布鲁氏菌DnaJ蛋白的表达及功能分析

本试验旨在运用分子生物学与生物信息学方法对布鲁氏菌DnaJ蛋白进行分析;将该蛋白进行原核表达,并检验纯化蛋白在体外或体内诱导Th1和Th2型免疫反应的能力。以布鲁氏菌M5-90为模板成功扩增目的基因DnaJ,构建重组表达载体pET-30a-DnaJ;利用SDS-PAGE检测DnaJ重组蛋白在大肠杆菌中的表达,并对其进行纯化;用DnaJ蛋白刺激RAW 264.7细胞和小鼠脾细胞,并用DnaJ蛋白免疫小鼠;利用ELISA试剂盒检测细胞因子IFN-γ、IL-4及小鼠血清中IgG1和IgG2a抗体水平的变化。结果显示,DnaJ蛋白二级结构以无规则卷曲结构为主,该蛋白有11个抗原决定簇;SDS-PAGE结果显示,重组菌在37.7 kDa大小的位置有特异表达条带,获得了DnaJ纯化蛋白;DnaJ蛋白可诱导宿主细胞和小鼠产生高水平IFN-γ、IL-4、IgG1和IgG2a抗体。鉴于DnaJ蛋白可在体外或体内诱导Th1和Th2型免疫反应,有望成为布鲁氏菌病的候选亚单位疫苗。     

铜仁地区羊布氏杆菌病血清流行病学调查

[目的]了解铜仁地区山羊布鲁氏菌病血清流行病学情况。[方法]通过平板凝集试验和试管凝集试验,对2012—2015年从铜仁地区8县2区54家养羊场采集的8 640份血清样品进行了检测。[结果]铜仁地区羊群中存在布鲁氏菌病的感染;2012—2015年的阳性率分别为3.56%、4.72%、11.25%和8.33%,春季平均阳性率为7.57%,秋季平均阳性率为6.18%。[结论]此次血清学调查结果为铜仁市布鲁氏菌病的防控提供了科学依据。     

规模化猪场O型口蹄疫抗体水平监测与分析

为切实猪O型口蹄疫抗体的免疫情况,科学评估免疫的质量,采用间接ELISA方法定点对17个规模猪场育肥猪108份、保育猪117份、哺乳仔猪121份、母猪60份、公猪104份(春、秋季各510份),共计1 020份猪O型口蹄疫免疫抗体血清进行检测,结果显示,春季阳性414份,平均免疫合格率为81.83%,大于农业部规定的标准(≥70.00%),免疫合格率较低的为65.00%和68.33%,未达到农业部规定的标准,不同类型猪的阳性水平春季平均阳性率74.10%,公猪阳性率94.23%,阳性率最高,其次是母猪77.78%,依次是育肥猪72.22%、保育猪70.08%、哺乳仔猪56.20%。秋季平均免疫合格率为85.00%,大于农业部规定的标准,免疫合格率最高96.67%,最低合格率70.00%,不同类型猪阳性水平,平均阳性率81.70%,母猪阳性率95.56%,阳性率最高,其次是育肥猪89.81%,然后依次是公猪88.46%、保育猪74.35%、哺乳仔猪60.33%。综合:2015年两次监测猪O型口蹄疫抗体中,春、秋季各地区猪O型口蹄疫抗体水平差异较大,大部地区免疫合格率均大于农业部规定的标准,部分地区抗体水平有待提高,哺乳仔猪的免疫水平较低。     

二氢杨梅素对杂交鲟幼鱼的生长性能、肌肉品质及血清指标的影响

本实验旨在研究饲料中不同水平的二氢杨梅素对杂交鲟(Acipenser schrenckii♀×Acipenser baerii♂)幼鱼生长性能、血清生化及免疫指标、肌肉常规及氨基酸组成、肠道形态、消化酶活性及微生物多样性的影响。实验将平均体重为(33.02±1.39)g/尾的180尾杂交鲟,随机分为4组,每组3个重复,每个重复15尾鱼,分别投喂二氢杨梅素添加水平分别为0(对照组),0.15%、0.3%、0.6%的实验饲料60 d。结果显示：0.6%组杂交鲟的增重率和特定生长率显著低于对照组;0.15%组血清中总胆固醇、白蛋白和葡萄糖水平均显著高于对照组,0.3%组血清中谷草转氨酶水平显著低于对照组,0.3%组血清中白蛋白和葡萄糖水平显著高于对照组,0.6%组血清中谷草转氨酶、白蛋白和甘油三酯水平显著高于对照组;各实验组血清中碱性磷酸酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶和总抗氧化能力均显著高于对照组。0.15%和0.3%组肠道中蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性均显著高于对照组。各实验组肌肉中常规组分、总氨基酸含量、必需氨基酸含量和鲜味氨基酸含量与对照组无显著性差异。综上所述,饲料...     

PI3K/Akt信号通路对布鲁氏菌介导的细胞凋亡基因表达的影响

[目的]研究阻断PI3K/Akt信号通路对布鲁氏菌介导的细胞凋亡的影响。[方法]用抑制剂LY294002(LY)作用于细胞1 h,然后将布鲁氏菌16 M侵染细胞,应用实时定量PCR检测16 M对巨噬细胞内凋亡相关基因Caspase-3活性和Bax mRNA表达的影响。[结果]阻断PI3K/Akt信号通路可显著提高16 M介导的caspase-3活性和Bax mRNA水平。[结论]PI3K/Akt信号通路可调控布鲁氏菌介导的细胞凋亡。     

泛素结合酶UBE2T基因在布鲁氏菌感染过程中的作用

【目的】探讨泛素结合酶E2T（UBE2T）在布鲁氏菌感染过程中的功能。【方法】构建UBE2T基因过表达载体pLVX-puro-UBE2T,对其进行PCR和EcoR Ⅰ/BamH Ⅰ双酶切验证,并将其转染小鼠巨噬细胞RAW264.7,利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测UBE2T基因过表达效果。设计并合成3条UBE2T基因沉默表达的siRNA（UBE2T-379-siRNA、UBE2T-599-siRNA和UBE2T-661-siRNA）,将其转染小鼠巨噬细胞RAW264.7,利用qRT-PCR检测UBE2T基因沉默表达效果。采用四甲基偶氮唑盐（MTT）试验,检测UBE2T沉默或过表达对RAW264.7细胞活性的影响。利用qRT-PCR,检测M5-90感染对RAW264.7细胞UBE2T基因相对表达量的影响,以及对过表达或沉默表达UBE2T基因的RAW264.7细胞中含pyrin结构域NOD样受体家族3（NLRP3）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶1（Caspase-1）基因相对表达量的影响。用布鲁氏菌M5-90菌株感染过表达和沉默UBE2T基因的RAW264.7细胞,用活菌计数法检测UBE2T沉默或过表达对RAW264.7细胞内布鲁氏菌增殖的影响,利用相应的试剂盒检测细胞乳酸脱氢酶（LDH）水平、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3（Caspase-3）活性及白细胞介素6（IL-6）、IL-18、IL-1β和γ-干扰素（IFN-γ）等细胞因子的水平。【结果】成功构建了UBE2T基因过表达载体pLVX-puro-UBE2T,过表达效果良好。3条siRNA中,UBE2T-661-siRNA的干扰效果最佳,其对UBE2T基因的沉默效率为84%。UBE2T沉默或过表达对RAW264.7细胞活性无影响。M5-90感染可提高RAW264.7细胞UBE2T的表达量;沉默UBE2T可提高M5-90介导的NLRP3和Caspase-1的表达,而过表达UBE2T会抑制M5-90介导的NLRP3表达,提高M5-90介导的Caspase-1表达。沉默表达UBE2T可抑制胞内M5-90的增殖,而过表达UBE2T可促进胞内M5-90的增殖。沉默表达UBE2T可抑制M5-90介导的LDH水平,提高Caspase-3活性及IFN-γ、IL-6和IL-1β水平;而过表达UBE2T可提高M5-90介导的LDH水平,抑制Caspase-3的活性及IFN-γ、IL-1β水平。【结论】泛素结合酶UBE2T对胞内布鲁氏菌增殖具有正调控作用。     

铜仁学院野生动植物保护与利用学科建设思路

野生动植物保护与利用学科是林学学科内的二级学科,该学科研究是人类生态文明建设和经济发展的主题,具有可持续性,以及十分重要的研究地位。铜仁学院在该学科建设方面已形成特色,并以提高贵州乃至我国野生动植物资源的生态、经济和社会效益为最终研究目标。笔者分析了野生动植物保护与利用学科的现状和主要研究方向的特色,以及目前该学科在国内省内同类学科中所具有的优势,重点探讨了该学科的建设思路,旨在助力学科建设与发展。     

MyD88在绵羊肺炎支原体感染过程中的作用

为分析MyD88在绵羊肺炎支原体(MO)感染肺泡上皮细胞中的分子机制。用不同浓度的抑制剂ST2825与细胞孵育24 h,用MTT法检测细胞活性;MO感染细胞后,于4、8、12、24 h收集细胞,利用实时定量PCR检测MyD88 mRNA的表达水平。采用不同浓度的MyD88抑制剂ST2825与细胞孵育1 h,然后用MO感染细胞,于24 h收集细胞,利用实时定量PCR检测白细胞介素-8(IL-8)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)mRNA的表达水平,用试剂盒检测caspase-3活性、caspase-8活性、H_2O_2浓度、NO浓度和LDH浓度变化。结果显示,MO于4、8、12、24 h显著提高细胞MyD88 mRNA表达水平;MO显著提高细胞IL-8 mRNA水平、TNF-α mRNA水平、caspase-3活性、caspase-8活性、H_2O_2浓度、NO浓度和LDH浓度(P0.01),而ST2825(浓度为10μmol/L和20μmol/L)能够显著降低MO介导的以上指标(P0.05),表明MyD88在MO感染肺泡上皮细胞过程中发挥重要作用。     

MyD88抑制剂ST2825对丝状支原体山羊亚种 感染宿主细胞的影响

为分析MyD88在丝状支原体山羊亚种(Mmc)感染肺泡上皮细胞中的分子机制。以山羊肺泡上皮细胞为材料,用不同浓度的MyD88抑制剂(ST2825)与细胞孵育,MTT法检测细胞活性,试剂盒检测caspase-3的活性,以及实时定量PCR检测MyD88和TNF-a mRNA的表达水平,试剂盒检测H_2O_2浓度和NO浓度。当ST2825浓度为5、10和20μmol·L~(-1)不影响细胞活性,而浓度为40μmol·L~(-1)时细胞活性显著降低;感染比例(MOI)为10,感染时间为8、12和24 h,Mmc可以显著提高MyD88 mRNA的表达水平(P0.01);可显著提高caspase-3的活性,而ST2825能够显著降低caspase-3(P0.05);感染时间为24 h,Mmc可显著提高TNF-a mRNA的表达水平、H_2O_2浓度和NO浓度(P0.05),而ST2825在10和20μmol·L~(-1)的浓度时,可显著降低Mmc介导的caspase-3活性、H_2O_2浓度以及LDH水平(P0.05),ST2825在5、10和20μmol·L~(-1)浓度时可显著降低TNF-a mRNA的表达水平和NO浓度(P0.05)。     

磷脂酰肌醇3激酶抑制剂LY294002对李斯特菌感染的影响

为检测磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)抑制剂LY294002对单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,L.monocytogenes)在小鼠脑微血管内皮细胞内存活的影响。将不同浓度抑制剂LY294002与细胞共同孵育,MTT法检测不同浓度抑制剂LY294002对细胞活性的影响,然后将L.monocytogenes分别感染细胞,利用菌落计数法计算L.monocytogenes的胞内细菌数量,检测LY294002对L.monocytogenes介导的小鼠生存曲线的影响,利用试剂盒检测抑制剂LY294002对L.monocytogenes介导的LDH和IFN-γ分泌的影响。抑制剂LY294002在5μmol/L、10μmol/L或20μmol/L浓度时不影响细胞活性,LY294002显著抑制了L.monocytogenes的胞内和脏器内细菌数量,提高L.monocytogenes介导的小鼠存活率,分别显著提高和降低L.monocytogenes介导的IFN-γ水平和LDH水平(P0.05)。本研究表明,LY294002可调控细胞内Lm的存活,为L.monocytogenes引起脑膜炎的致病机制提供科学依据。