海七鳃鳗CXCL8基因的原核表达及蛋白纯化

海七鳃鳗(Petromyzon marinus)是现存最古老的无颌类脊椎动物之一,对其重要免疫分子的研究在免疫系统的进化理论上有重要意义。细胞趋化因子CXCL8(又称白细胞介素-8,Interleukin 8)是最重要的趋化因子之一。为了研究海七鳃鳗CXCL8基因在天然免疫中的作用,以海七鳃鳗肝脏c DNA为模板,通过比对海七鳃鳗基因组信息设计引物,使用RT-PCR方法扩增得到PmCXCL8基因。随后构建原核表达载体pColdI-CXCL8,将载体转化至E.coli BL21和Rosetta(DE3)中进行表达,利用Bio-Rad IMAC蛋白质纯化试剂盒和Profinia蛋白质纯化系统进行纯化,纯化后的蛋白进行SDS-PAGE电泳和Western blot分析。结果显示,PmCXCL8开放阅读框(open reading frame,ORF)为309 bp,编码102个氨基酸,分子量为11.23 kDa,等电点为9.37。PmCXCL8氨基酸序列中保守的C36和C38之间插入一个氨基酸残基,为CXC型趋化因子,而且不含ELR(Glu-Leu-Arg)基序,相应位置被GGR(Gly-Gly-Arg)所替代。原核表达对比发现,该蛋白在E.coli Rosetta(DE3)中的表达优于E.coli BL21,最后通过亲和层析法纯化得到了高纯度的PmCXCL8重组蛋白。SDS-PAGE电泳检测和Western blot鉴定结果均得到单一的条带,分子量约为11.23 k Da,符合预期结果,表明已成功表达出可溶性良好的PmCXCL8重组蛋白。该研究为PmCXCL8功能的探究与抗体的制备提供了实验材料,也为七鳃鳗天然免疫系统进化的研究奠定了基础。     

东北七鳃鳗NF-κB基因启动子的构建及活性

核转录因子NF-κB (nuclear factor kappa B)对机体的免疫反应、炎症反应等起重要的调控作用。为了获得NF-κB基因启动子的活性报告基因,进一步研究原始脊椎动物免疫应答的机制,实验根据此前克隆得到的东北七鳃鳗NF-κB基因的编码序列(coding sequence,CDS),以与东北七鳃鳗高度同源的日本七鳃鳗同源基因5′上游启动子特征序列为模板设计引物,克隆获得了东北七鳃鳗NF-κB启动子序列,该序列全长3 169 bp,提交至NCBI数据库GenBank获得登录号MN368861。经AliBaba 2.1软件预测该序列包含CREB (cgtgacttca)、Oct-1 (aatatgaatt)、GATA-1 (gaacctatct)、AP-1 (ggttgagtca)、NF-kappa B (ctttcctgtt)、IRF-1 (tttcctgttc)、Sp-1 (tgtgaggggt)、c-Jun (acgtgacttc)和c-Fos (ggttgagtca)等多个转录因子结合位点,并包含TATA box转录核心元件。通过MethPrimer软件预测在序列1 ...