基因枪法介导的转KN2基因小麦的获得及鉴定

【目的】获得转KN2基因的小麦植株,为研究KN2基因对提高转基因小麦抗寒性的作用,以及为利用基因工程提高小麦抗逆性奠定基础。【方法】以弱冬性小麦品种小偃22为供试材料,通过基因枪法,用含有KN2基因的植物表达载体和筛选标记基因bar共转化小麦幼胚愈伤组织,经过除草剂(Phosphinothricin,草丁膦)筛选和愈伤组织分化获得再生植株,并对得到的再生小麦植株进行PCR检测。【结果】采用基因枪法共轰击小偃22的幼胚愈伤组织1 680个,共获得再生植株17株,移栽到花盆中成活15株;根据目标基因序列设计特异引物,对成活的小麦植株进行PCR检测,结果表明获得含有bar基因和KN2基因的转基因阳性植株分别为6株和4株,转化率分别为0.36%和0.24%,bar和KN2的共转化率为0.24%。【结论】KN2基因成功地转入到小麦品种小偃22中。     

TaNAC14转基因小麦外源目标基因拷贝数及遗传稳定性分析

外源基因拷贝数是影响转基因植物遗传稳定性及其自身表达水平的重要因素。为了探析TaNAC14基因在小麦生长发育中的生物学功能,本研究通过农杆菌介导的遗传转化法获得了14个T0代TaNAC14转基因小麦植株,采用BASTA溶液涂抹和目标序列PCR检测相结合的方法,从14个转基因小麦植株中鉴定出9个阳性植株。通过TaqMan实时定量PCR方法,以小麦内源单拷贝基因Pinb为内参基因,对9个T0代转基因小麦阳性植株中外源目标基因拷贝数进行检测,结果表明,T0代转基因小麦再生植株中有5株为单拷贝,4株为双拷贝,其中单拷贝插入整合的比率接近55.6%。选取单拷贝转基因植株收获的种子进行种植,根据BASTA溶液涂抹鉴定对T0:1代小麦株系遗传情况进行分析,结果表明目标基因TaNAC14是可遗传的。此外,还对T1代转基因小麦目标基因表达水平进行测定,结果表明,与野生型JW1相比,各转基因小麦植株目的基因TaNAC14表达量均极显著增加。该研究结果为后续TaNAC14基因的功能研究奠定了基础。     

基因枪介导的转PYL5基因小麦的获得与鉴定

【目的】通过基因枪介导共转化,获得转拟南芥抗旱基因PYL5的小麦植株,为转基因小麦的抗旱功能研究奠定基础。【方法】以小麦品种西农889、绵阳19和宁春16为供试材料,通过基因枪介导法将诱导型启动子Rd29A启动的PYL5基因和筛选标记基因Bar共转化到小麦幼胚愈伤组织中,经过除草剂PPT(Phosphinothricin)筛选和愈伤组织分化,获得再生植株。根据目标基因PYL5和Bar基因序列分别设计特异引物,对移栽成活的小麦T0代再生植株进行基因特异性PCR检测。【结果】采用基因枪分别轰击西农889的1800个、绵阳19的800个和宁春16的800个幼胚愈伤组织,经过筛选和分化分别获得了9,5和14株小麦再生植株;对转基因小麦T0代再生植株的基因特异性PCR检测结果表明,西农889、绵阳19和宁春16 Bar基因的转化率分别为0.280%,0.500%和0.750%,PYL5基因的转化率分别为0.110%,0.125%和0.500%,Bar和PYL5基因的共转化率分别为0.110%,0.125%和0.500%。【结论】PYL5基因成功转入到了小麦品种西农889、绵阳19和宁春16中。