小麦TaeEF1β基因的克隆、同源性及表达分析

真核翻译延伸因子(eukaryotic translation elongation factor,eEFs)是一种重要的多功能调控蛋白,eEF1β是eEF1的组成部分,在蛋白质生物合成过程中发挥着重要的作用。本文通过RT-PCR扩增克隆小麦(Triticum aestivum L.)的eEF1β基因,并命名为TaeEF1β。氨基酸同源性分析发现,TaeEF1β具有高度保守性,且其保守结构域位于137~226 aa处。qRT-PCR结果表明,中国小麦花叶病毒(Chinese wheat mosaic virus,CWMV)侵染小麦植株后,可以诱导TaeEF1β基因转录水平的上调表达。另外,本文也进一步分析了TaeEF1β基因在小麦根、茎、叶的表达水平和CWMV侵染不同时间点的表达情况。     

中国小麦花叶病毒(CWMV)侵染条件下小麦内参基因的选择

实时定量PCR(qRT-PCR)是分析功能基因表达水平的常用方法之一,qRT-PCR数据统计分析离不开合适内参基因的选择。为了选择中国小麦花叶病毒(Chinese wheat mosaic virus, CWMV)侵染条件下的小麦内参基因,本实验通过PCR扩增效率和扩增特异性分析,从10个持家基因中选择8个候选基因,然后以接种CWMV的小麦样品为材料,利用qRT-PCR技术进一步检测上述8个基因在CWMV侵染条件下小麦样品中的时空表达特性。基于这些数据,通过geNorm、NormFinder程序分析,结果表明,2个小麦基因(即26S和CDC)在CWMV侵染前后以及不同组织中表达最为稳定,26S和CDC组合可选作CWMV与小麦互作过程中功能基因表达分析的内参基因。     

一个水稻小热休克蛋白的异源表达及寡聚特性分析

【目的】在前期研究中,本实验室已克隆了一个水稻小热休克蛋白基因(OsSHSP17.6),并发现该基因的表达明显受到热激和病毒侵染调控,表明该蛋白可能在逆境胁迫过程中起重要作用。本研究的目的在于进一步明确OsSHSP17.6的特性。【方法】在本研究中,进一步将该基因亚克隆至原核表达载体p ET-32a并导入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)pLysS诱导表达,通过亲和层析的方法纯化了该重组蛋白,进一步用于非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blotting分析。【结果】异源表达的重组OsSHSP17.6能减轻IPTG对宿主菌的毒害。非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blotting分析显示纯化的重组OsSHSP17.6蛋白在体外能形成同源二聚体和寡聚体。【结论】这些结果支持OsSHSP17.6是一个有功能的分子伴侣蛋白并表明该蛋白可能通过形成同源寡聚体的方式参与逆境胁迫反应,这为进一步明确OsSHSP17.6的功能机制奠定基础。     

外源水杨酸对水稻苗期生长与防卫相关基因表达的影响

为探究外源水杨酸(SA)对水稻苗期生长与SA相关防卫反应的影响,用不同浓度外源SA喷施苗期日本晴水稻,利用分光光度计测定水稻苗期生长关键指标叶绿素含量,采用qRT-PCR定量分析外源SA对水稻苗期SA合成基因PAL1、SA受体基因NPR1、SA信号途径下游的转录因子WRKY45/WRKY76和防卫基因PR1a/PR1b的表达水平。结果表明,外源SA对上述水稻基因的影响不同,即低浓度SA在一定程度上促进水稻苗期叶绿素积累,并显著影响水稻苗期防卫相关基因的表达水平;高浓度SA抑制叶绿素的积累,影响水稻的正常生长。综合比较结果显示,喷施2.0 mmol·L^-1外源SA对水稻苗期防卫相关基因表达的影响最为有效,该结果为进一步探索外源SA促进水稻苗期生长并提高水稻苗期防卫能力的作用研究奠定基础。     

水稻瘤矮病毒P12蛋白抗血清制备及其应用

为了进一步研究水稻瘤矮病毒(Rice gall dwarf virus,RGDV)P12的功能,将RGDV-GX P12编码区亚克隆至原核表达载体,并导入大肠杆菌诱导表达;重组的P12融合蛋白经Ni-NTA His·Bind Resins纯化后用于免疫小鼠制备抗血清,并进行Western blotting分析。结果显示,约41 kD大小的RGDV P12融合蛋白可在大肠杆菌中高效表达;利用该重组蛋白所制备的抗血清可特异地与融合表达和非融合的P12蛋白发生强烈的免疫学反应。利用该特异性抗血清在病毒粒子样品中检测不到P12蛋白,而在病株总蛋白样品中可检测到1条与预期大小一致的明显条带,表明RGDV P12是一种非结构蛋白。     

水稻黑条矮缩病毒基因组片段S10的cDNA克隆及全序列分析

基于RT-PCR策略克隆了水稻黑条矮缩病毒（rice black streaked dwarf virus,RBSDV）浙江分离株基因组S10,并测定了它的全序列。结果表明,水稻黑条矮缩病毒浙江分离物（RBSDV-Zj）基因组片段S10全长1801 nt（EMBL登录号为AJ297433）,仅含有一个大的开放阅读框（open reading frame,ORF）,编码一个63.1 kD的多肽,与日本的水稻黑条矮缩病毒基因组片段S10在核苷酸和氨基酸水平上同源性分别为93.8%和96.2%;与意大利玉米粗缩病毒（maize rough dwarf virus,MRDV）的基因组片段S10在核苷酸和氨基酸水平上的同源性分别为87.7%和92.0%,推测它们是同一病毒的不同地理小种。     

与水稻黑条矮缩病毒p5b互作的水稻基因片段筛选

 由水稻黑条矮缩病毒基因组S5片段第2个开放阅读框（ORF）编码的p5b是一个功能未知的病毒非结构蛋白。构建了酵母双杂交体系的含水稻cDNA表达文库的pGADT7载体,同时将p5b 基因构建到诱饵质粒pGBKT7上（pGBK p5b）,Western Blot和自激活实验结果显示p5b可在酵母中正确表达且无自激活活性。进一步利用p5b蛋白作为诱饵用酵母双杂交筛选水稻cDNA表达文库,鉴定出一些参与光合作用、呼吸作用等重要代谢过程的关键酶基因片段,这些酶可能与p5b蛋白之间存在相互作用,推测这些互作在病株症状发展过程中起作用。     

水稻黑条矮缩病毒基因组S7编码的2个非结构蛋白在病株中的表达检测

 水稻黑条矮缩病毒（RBSDV）基因组片段S7含有2个非重叠的阅读框,所编码的蛋白分别为p7a和p7b。根据RBSDV S7序列（EU111804）设计特异性引物分别扩增编码p7a和p7b蛋白的基因片段,并亚克隆至原核表达载体pET 32a（+）和pSBET上,再以大肠杆菌BL21(DE3)pLysS或BL21(DE3)pLysE为宿主菌进行高水平表达,利用纯化的蛋白免疫小鼠,制备了p7a和p7b蛋白的特异性抗血清。蛋白质印迹分析表明p7a和p7b蛋白均在水稻病株中表达,但p7a含量较为丰富,易于在病株中检测到,而p7b在病株中含量则很低;在病毒粒子中,两者均未检测到任何信号,表明两者均为RBSDV的非结构蛋白。     

棉纤维细胞发育过程中纤维素的生物合成

棉纤维是由胚珠外珠被表皮细胞在受精前后经分化突起、伸长和细胞壁增厚而形成。棉花纤维单细胞发育同步性和次生壁形成期纤维素大量合成的特点已成为研究纤维素生物合成和细胞发育分子机制的模式植物之一。棉纤维中次生壁纤维素发育的时间、合成的速率和沉淀的类型极大地影响着棉花纤维长度和纤维强度,阐明棉纤维细胞纤维素生物合成的机制,将有助于推动棉纤维产量与品质改良的分子工程。本文主要介绍了棉纤维不同发育阶段纤维素合成的特点,纤维素合成的场所、底物,碳代谢模型,基因表达与调控的研究进展。     

烟草抗烟草花叶病毒基因N的研究

烟草的N基因是一个较为理想的抗烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus,TMV)基因，它和TMV之间的互作是植物和病毒互领域里一个经典的系统。烟草N基因已经分离，TMV基因组结构和功能已经研究得很清楚。这为进一步研究两者的互作奠定了基础，本文介绍了这一领域取得的最新进展用存在的问题。