野生大豆GsADF1基因的克隆与表达分析

ADF蛋白是一种在真核生物中广泛存在的低分子量的肌动蛋白结合蛋白,在细胞分裂、细胞运动、植物顶端生长如花粉管伸长,根毛的形成等重要的生命活动中发挥着重要的作用.以野生大豆(Glycine soja)的叶片cDNA为模板,通过RT-PCR方法扩增分离获得GsADF1基因.该基因全长为693 bp,包含417 bp的开放阅读框;其编码的ADF蛋白含139个氨基酸残基.运用生物信息学方法将GsADF1与其他物种ADF蛋白氨基酸序列进行多重比对并构建系统进化树,发现GsADF1与其它生物的ADF蛋白具有很高的同源性.这说明植物ADF基因高度保守.为进一步研究GsADF1在野生大豆不同组织,器官以及不同发育期大豆种子中的表达情况,对它进行了荧光定量分析(Real time RT-PCR).结果表明:GsADF1在野生材料的根、茎、叶、花和种子中都有表达,且以根和花中表达量最高.而对其在不同发育阶段的种子中的分析表明该基因在15DAF、20DAF、30DAF、40DAF和45DAF的种子中都有表达,且以15DAF表达量最低,随后呈上升趋势.其表达量的变化表明GsADFI通过调节肌动蛋白可能参与了种子从胚胎发生到贮藏物质积累的转变.     

大豆硫转运蛋白基因GmSULTR1;2b启动子的克隆及活性分析

【目的】硫转运蛋白（sulfate transporter,SULTR）参与根系对外界环境中硫酸根（SO₄^2-）的吸收与转运。大豆硫转运蛋白基因GmSULTR1;2b在根中特异表达,其功能是将外界的SO₄^2-吸收转运到植物根系中。文章克隆大豆硫转运蛋白GmSULTR1;2b的启动子,研究该启动子的驱动活性和组织表达情况,从而了解GmSULTR1;2b的调控机制,为提高大豆含硫氨基酸含量提供分子依据。【方法】根据NCBI中GmSULTR1;2b的序列,分析预测该基因上游2 259 bp为启动子,并利用在线数据库PLACE和Plant-CARE预测该启动子序列的调控元件。以大豆品种南农N2899的DNA为模板,进行普通PCR扩增,将克隆的启动子序列与GUS连接构建植物重组表达载体pSULTR1;2b∷GUS。利用冻融法将重组质粒转入农杆菌EHA105中,通过农杆菌介导的遗传转化法转化大豆进行瞬时表达,以GUS为报告基因对启动子的活性进行分析。另外,将重组质粒转入发根农杆菌K599中进行大豆毛状根转化试验,借助于GUS报告基因,通过体视镜观察毛状根的横切面,分析启动子在根中的表达情况。最后以转化的阳性毛状根为材料,通过GUS酶活试验（GUS activity）分析启动子的活性。【结果】克隆大豆品种南农N2899的GmSULTR1;2b启动子与NCBI序列基本一致。通过在线预测分析启动子的调控元件发现该启动子具有真核生物启动子必须的核心元件TATA-box外,还含有激素应答元件ERE（乙烯响应元件）、ABRE（脱落酸响应元件）等,胁迫应答元件TC-rich repeats（干旱胁迫以及病虫害胁迫）、AT-rich element（AT-rich的DNA与蛋白结合位点）和MYB等。重组载体pSULTR1;2b∷GUS经PCR和测序鉴定,证实已构建成功。大豆瞬时表达后进行X-gluc染色显示,重组载体侵染的大豆显蓝色,说明GmSULTR1;2b启动子能够驱动下游GUS的表达。对转化的毛状根染色之后,体视镜下观察阳性根的横切面,发现GUS主要在根毛、根表皮和中柱内表达,表明GmSULTR1;2b启动子主要在根毛、根表皮和中柱内表达。对转化毛状根进行GUS酶活试验（GUS activity）说明该启动子的启动活性比CaMV35S启动子的启动活性弱。【结论】克隆了GmSULTR1;2b启动子序列,该启动子具有驱动下游GUS的表达的功能,而且该启动子在根毛、根表皮和中柱内表达。