牦牛源产气荚膜梭菌β2基因的原核表达及生物信息学分析

为了原核表达一株牦牛源产气荚膜梭菌Qinghai-1的β2基因及了解其编码蛋白的生物信息。首先利用PCR扩增技术、基因克隆技术构建原核表达质粒并通过高通量测序、双酶切技术、SDS-PAGE检测和Western blotting方法对表达情况进行鉴定,其次利用生物信息学分析的方法对β2毒素蛋白的一级结构、二级结构、蛋白特殊区域、三级结构及B细胞线性抗原表位等多方面进行预测分析。原核表达结果显示：牦牛源产气荚膜梭菌β2基因在温度为37℃,IPTG浓度为1.5 mmoL/L,培养时间为8 h～10 h的条件下可得到大小约为28KD的可溶于细胞质的不含信号肽的目的蛋白。生物信息学分析结果显示：牦牛源产气荚膜梭菌β2基因大小为798 bp,共编码265个氨基酸,与印度的产气荚膜梭(FR687302.1)的β2毒素基因相似性最高;其分子式为C₁₃₉₂H₂₁₃₆N₃₅₆O₄₁₈S₁₁,分子量为30.9 ku,pI=6.04,负电荷(Asp+Glu)残基总数36个,正电荷(Arg+Lys)残基...     

青海玉树牦牛源产气荚膜梭菌的分离鉴定及耐药性研究

无菌采集青海玉树地区牦牛源腹泻粪样,利用常规方法和分子生物学技术对样品中的产气荚膜梭菌进行分离鉴定,通过动物试验、药敏试验、耐药基因检测等方法对分离到的菌株进行了分析。结果显示,从148份样品中成功分离鉴定出牦牛源产气荚膜梭菌14株,其中10株为A型,4株为C型。利用16S rRNA基因序列对部分分离菌系统遗传进化树分析,结果发现,YS-1(MW980090)与印度豹源(MN326666.1)产气荚膜梭菌具有较近的亲缘性,YS-4(MW980093)和YS-13(MW980102)为单独的一枝,YS-6(MW980095)与北京人源(KP944154.1)产气荚膜梭菌具有相似性。A型菌YS-1(MW980090)和C型菌株YS-6(MW980095)动物试验结果显示,C型产气荚膜梭菌外毒素具有强致死性,A、C型菌具有强致死性。药敏试验结果表明,分离菌对复方新诺明、多黏菌素、青霉素、多西环素、四环素耐药,对克林霉素、氯霉素、万古霉素、氧氟沙星敏感。本研究为预防和治疗因产气荚膜梭菌导致牦牛腹泻等疾病提供用药指导。     

1株牦牛源A型产气荚膜梭菌的生长特性及致病性研究

为了了解青海牦牛源产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens,Cp)的生长特性及致病性,并计算其对感染小鼠的半数致死量(LD₅₀),以及观察感染小鼠各器官组织的损伤情况,试验复苏牦牛源产气荚膜梭菌ZD-01(CpA ZD-01)并配制种子液,采用振荡比浊法绘制CpA ZD-01菌株的生长曲线,并研究对数期菌液的OD₆₀₀值与稀释倍数和细菌数量的关系;测定其外毒素粗提取液OD₂₈₀值和OD₂₆₀值,计算出不同培养时间毒素蛋白含量;给小鼠腹腔注射菌液,根据小鼠死亡情况确定LD₀和LD₁₀₀,并计算LD₅₀,解剖小鼠观察牦牛源CpA ZD-01菌株对各组织器官的影响。结果表明：按照5%接种量接种菌株后,>2～10 h为对数期;菌液OD₆₀₀值(y)与稀释倍数(x)的关系式为y=-0.607lnx+1.551,R²=0.990,P<0.05;菌液OD₆₀₀     

藏鸡源沙门氏菌分型鉴定及常用抗生素敏感性试验

本试验采集西藏拉萨、林芝两地共55份藏鸡腹泻粪便,参照细菌的培养特性、生化鉴定,K-B纸片法以及PCR扩增技术对样品中沙门氏菌进行分离鉴定,特异性基因鉴定,并对分离菌株进行血清型分型以及常用抗生素药物敏感性检测.结果表明:55份样品中共分离出8株沙门菌,分离率为14.55％(8/55),其中甲型副伤寒沙门氏菌为优势血清...     

牦牛源C型产气荚膜梭菌动物致病性及其β毒素基因生物信息分析

复苏培养本实验室保存的牦牛源C型产气荚膜梭菌Qinghai-06(GenBank登录号：MW980095),利用振荡比浊法、动物试验和病理切片方法对菌株生长曲线及动物致病性进行研究,随后通过对β毒素基因扩增、克隆、双向高通量测序、生物软件分析等分子生物学与生物信息学方法对其编码蛋白的一级结构、二级结构、三级结构、蛋白特殊区域及B细胞线性抗原表位进行分析。结果显示,牦牛源C型产气荚膜梭菌Qinghai-06菌株按照5%体积分数接种后,2～6 h为对数期;菌液D_{600 nm}值与稀释倍数的关系式为y=-0.857ln(x)+2.236;菌液D_{600 nm}值与菌落CFU的关系式为：y=0.881x-0.017;菌株对感染小鼠的LD₅₀为0.408×10⁸ CFU/mL。H.E染色镜检观察到可引起肠、脑、肾脏、肝脏、脾脏组织病理变化。β毒素基因序列长927 bp,共编码309个氨基酸,分子式为C₁₅₃₅H₂₃₉₆N₄₀₆O₅₀₂     

林芝市某藏猪养殖场6种腹泻病原的检测与分析

为了解西藏林芝市某藏猪养殖场猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)、猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus, PDCoV)、传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus, TGEV)、A群轮状病毒(Rotavirus A,RVA)、产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)和肠炎沙门氏菌(Salmonella enteriditis,SE)6种腹泻病原的流行情况，于2021年在该养殖场采集藏猪腹泻粪便样本40份，通过PCR方法对6种病原进行检测。结果表明：40份被检样本中PEDV、PDCoV、TGEV、RVA、ETEC、SE的阳性率分别为50.0%(20/40)、12.5%(5/40)、17.5%(7/40)、10.0%(4/40)、52.5%(21/40)和30.0%(12/40);且60.6%样本中检测出两种或两种以上病原体，其中18.2%样本出现了4种病原混合感染的情况。说明该藏猪养殖场存在多种腹泻病原...     

1株青海牦牛腹泻产气荚膜梭菌基因分型及cpa基因生物信息学分析

为了解1株从青海玉树地区牦牛腹泻中分离的牦牛源产气荚膜梭菌Qinghai-1的分子型和cpa基因编码蛋白的生物信息，首先利用16S rDNA扩增、毒素基因检测、MLST分型、基因克隆等分子生物学方法对菌株毒素基因和管家基因进行分析，随后通过对cpa基因双向高通量测序、生物软件分析等生物信息学方法对其编码的α毒素蛋白的一级结构、二级结构、三级结构、蛋白特殊区域、B细胞线性抗原表位及蛋白互作关系进行分析。结果显示，Qinghai-1菌株分型毒素仅含有α毒素，各管家基因的等位基因序号依次为colA:9、groEL:96、sodA:91、plc:44、gyrB:67、sigK:55、pgk:8、nadA:16;cpa基因全长1 197 bp,共编码398个氨基酸，与丹麦鸡源(EU839784.1)分离株plc基因差异性较小；其编码的α毒素蛋白分子式为C₂₀₃₆H₃₀₆₁N₅₃₃O₆₃₁S₁₂,相对分子质量为45.5 ku, pI=5.68,脂肪指数：61.36,不稳定指数：19.88,...