泰勒虫重组抗原Tams1-spag基因原核表达与纯化

为了在低成本的情况下,得到高浓度、高纯度的环形泰勒虫表面重组抗原的融合蛋白,设定表达过程中不同的OD600nm、IPTG浓度与诱导时间,探索最佳表达条件。通过KCl染色法切胶后分别经透析袋电洗脱法与快速离心法回收目的蛋白。对上述试验的蛋白样品进行SDS-PAGE和Western blot检测。结果表明,在OD600nm=1时加入浓度为1mmol/L IPTG,过夜诱导时,重组蛋白的表达量最大。在KCl染色法切胶回收目的条带的基础上,电洗脱法与快速离心法均能得到同等浓度的高纯度目的蛋白,经Western blot检测重组蛋白的生物活性没有改变,仍具有良好的反应原性。     

响应面法优化牛血二次发酵条件

在牛血二次发酵过程中会产生出更多的小分子蛋白质,有利于提高动物对牛血蛋白质的吸收和利用,提高牛血在饲料中的利用价值。试验在首次发酵牛血的基础上进行二次发酵,利用响应面法更加准确地寻找出高效的二次发酵工艺及最适宜的发酵条件。试验结果表明:在发酵时间为50 h、温度为30℃和黑曲霉接种量为0.3%时,发酵后牛血小肽含量最高,最大预测值为提高7.7%,实测值为提高7.9%,两者基本相符。     

IPTG诱导浓度、时间对AsiaⅠ型口蹄疫病毒VP1蛋白表达的影响

将口蹄疫病毒VP1基因插入原核表达载体pET-28a中,转化至大肠杆菌BL21.用不同的IPTG浓度与不同诱导时间诱导菌株表达VP1蛋向,分析不同IPTG浓度及不同诱导时间对蛋白表达量的影响,以确定最佳表达条件.结果表明,在一定范围内,随IPTG浓度的增高,表达量并不会随之增大;而在菌体对数生长期内,随诱导时间的延长,表达量会随之增大.最后确定当IPTG浓度为3 mmol/L,诱导表达到最长时间9 h时,VP1蛋白表达量最大.     

口蹄疫病毒VP1基因的原核可溶性表达

针对重组原核表达载体表达目的蛋白以包涵体形式存在的问题,作者对影响外源蛋白表达的IPTG的浓度、温度、时间等因素均进行了探索,以观察VP1蛋白的可溶性情况。通过PCR技术将VP1基因克隆至pGEM-T载体中,然后将pET-28a(+)和pGEM-T载体分别进行双酶切,构建重组的pET-28a-VP1载体,将重组载体转化至BL21中,诱导后经SDS-PAGE检测可见约29 ku的目的蛋白条带。插入的外源目的蛋白主要以包涵体的形式存在,上清中的可溶性蛋白甚微。试验结果表明,这可能与蛋白本身的氨基酸组成有重要关联。     

泰勒焦虫重组蛋白 TaSP-Tams1-SPAG1间接ELISA 检测方法的建立

以真核表达的焦虫表面抗原重组蛋白 TaSP-Tams1-SPAG1作为 ELISA 板包被抗原,通过方阵实验确定抗原包被浓度,探索抗原包被时间、温度、一抗及二抗血清稀释度及作用时间,建立牛环形泰勒焦虫表面抗原重组蛋白 ELISA 方法.结果得出 TaSP-Tams1-SPAG1的最佳包被浓度为10μg/mL,血清最佳稀释度为1∶100, ELISA 阳性反应的临界值为 OD 492nm ≥0．348,重复试验变异系数小于12％,所建立的 ELISA 方法不与牛巴贝斯虫及牛瑟氏泰勒虫血清发生反应.TaSP-Tams1-SPAG1为抗原建立的 ELISA 方法特异性强,敏感度高,重复性好,为牛环形泰勒焦虫病的准确检测及防治提供技术支持.     

口蹄疫病毒VP1基因的原核可溶性表达

针对重组原核表达载体表达目的蛋白以包涵体形式存在的问题,作者对影响外源蛋白表达的IPTG的浓度、温度、时间等因素均进行了探索.以观察VP1蛋白的可溶性情况.通过PCR技术将VP1基因克隆至pGEM-T载体中,然后将pET-28a(+)和pGEM-T载体分别进行双酶切.构建重组的pET-28a-VP1载体,将重组载体转化至BL21中,诱导后经SDS-PAGE检测可见约29 ku的目的蛋白条带.插入的外源目的蛋白主要以包涵体的形式存在,上清中的可溶性蛋白甚微.试验结果表明,这可能与蛋白本身的氨基酸组成有重要关联.     

绵羊痘病毒新疆株的分离及结构蛋白P32基因序列分析

[目的]对绵羊痘病毒当地流行毒株的分离和其结构蛋白P32基因的克隆和序列进行分析,明确引起新疆本地绵羊流行痘病的病毒种类,掌握当前流行毒株的变异情况,为绵羊痘的预防控制及将来研制高效安全疫苗提供科学依据.[方法]将两例疑似患有羊痘的绵羊肺脏组织病料接种于MDBK细胞进行病毒分离,细胞病变组织经处理后通过电子显微镜观察分离病毒.以分离病毒基因组DNA为模板,通过PCR扩增绵羊痘病毒结构蛋白P32基因,并对目的基因进行克隆和基因序列和蛋白生物信息学分析.[结果]两例病料组织接种MDBK细胞后均产生明显的细胞病变,电子显微镜观察可见到约200 nm大小、椭圆形有囊膜的典型痘病毒粒子.对两株病毒表面膜结构蛋白P32基因PCR扩增均可获得与预期大小一致的约972 bp片段,氨基酸序列分析表明分离毒株SPV/Miquang/2013和SPV/Kuche/2013病毒P32基因与绵羊痘病毒参考株同源性分别达96.9;～99.4;和97.5;～100;,生物信息学分析发现SPV/Miquang/2013株P32蛋白有两个关键氨基酸位点发生变异,即第78位谷氨酸突变为赖氨酸,第293位异亮氨酸突变为苏氨酸.[结论]从疑似病例中分离到两株病毒,通过电镜观察及P32基因扩增测序,与其他羊痘病毒比对后鉴定分离毒株为绵羊痘病毒,分别命名为SPV/Miquan/2013和SPV/Kuche/2013.SPV/Miquan/2013的P32蛋白同其他绵羊痘病毒的两个氨基酸位点发生明显突变.     

IPTG诱导浓度、时间对Asia I型口蹄疫病毒VP1蛋白表达的影响

将口蹄疫病毒VP1基因插入原核表达载体pET-28a中,转化至大肠杆菌BL21。用不同的IPTG浓度与不同诱导时间诱导菌株表达VP1蛋白,分析不同IPTG浓度及不同诱导时间对蛋白表达量的影响,以确定最佳表达条件。结果表明,在一定范围内,随IPTG浓度的增高,表达量并不会随之增大;而在菌体对数生长期内,随诱导时间的延长,表达量会随之增大。最后确定当IPTG浓度为3 mmol/L,诱导表达到最长时间9 h时,VP1蛋白表达量最大。     

环形泰勒虫表面抗原Tams1-Spag1串联表达及其蛋白的生物信息学分析

为了研究环形泰勒虫表面抗原特性,以原核表达系统串联表达表面抗原Tams1-Spag1基因,并对其蛋白进行生物信息学分析。通过PCR技术扩增Tams1-Spag1基因片段后构建重组质粒p ET-28a-Tams1-Spag1,IPTG诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE与Western-blot检测显示,得到大小与预期分子量相当的目的蛋白;生物信息学分析发现,此串联重组蛋白Tams1-Spag1具有219个氨基酸,属于非分泌型亲水性蛋白,分别具有13个与11个可能的糖基化与磷酸化位点,存在两个低复杂性的结构域,一个NOT的结构域,预测有6个B细胞表位优势区段与10个T细胞表位优势区段,存在两段交叉反应性表位肽。本研究为深入探讨串联重组蛋白的免疫原性提供理论依据。     

狂犬病病毒SRV9株N、P、G和L蛋白基因的克隆及表达载体构建

以狂犬病病毒RNA为模板,采用RT-PCR方法克隆获取N、P、G及L蛋白编码基因核苷酸序列,应用定向克隆技术,构建真核表达载体 pcDNA3.1-N、pcDNA3.1-P、pcDNA3.1-G及pcDNA3.1-L.经测序鉴定证实获取的N、P、G及L蛋白区全长核苷酸序列与文献报道的一致,并成功构建了其真核表达载体.