牛卵泡TEDDM1表达特点及其功能分析

旨在研究牛卵泡跨膜附睾蛋白1(transmembrane epididymal protein 1,TEDDM1)的分子特征和立体结构,并结合TEDDM1在不同生理状态牛卵泡的表达特性分析其功能。本研究采集牛发情期第一卵泡波优势卵泡(dominant follicle,DF)和从属卵泡(subordinate follicle,SF),分别分离颗粒细胞(granulosa cells,GCs),提取总RNA后反转录,设计牛 TEDDM 1特异性引物进行PCR扩增、克隆、测序,获得全CDS区后运用生物信息学方法对序列结构进行分析;以牛 RPLP 0作为内参基因,在DF和SF中使用qRT-PCR对 TEDDM 1的表达量进行检测;兔抗TEDDM1一抗检测TEDDM1在牛卵泡中的表达和定位。结果表明, TEDDM 1基因CDS区全长903 bp,编码300个氨基酸,有7次跨膜的α螺旋结构,属于典型的G蛋白偶联受体,该基因氨基酸序列与非洲野牛( Bison bison bison )序列相似性最高,为99.4%;功能域分析表明,TEDDM1分子中存在未知功能结构域,蛋白家族716(domains of unknown function protein families 716,DUF716)结构域。qRT-PCR分析表明, TEDDM 1 mRNA在SF的表达量显著高于DF( P <0.05);免疫组化分析表明,TEDDM1在DF和SF的颗粒层和膜层细胞均有表达,特异性显色强度表明TEDDM1在SF颗粒层和膜层细胞表达量均高于DF。本研究为进一步探讨TEDDM1在牛卵泡发育过程中的调控作用及其在信号转导和激素调节中的功能提供了依据,为后期深入研究牛卵泡发育机理奠定基础。     

牛卵泡AGTR2序列结构及表达特性分析

【目的】研究牛卵泡发育过程中关键调控蛋白CART的候选受体AGTR2的分子特征和立体结构,并结合AGTR2在不同生理状态牛卵泡的表达特性分析其功能。【方法】 同期发情处理后,经B超声波连续监测（每12 h 一次）采集牛双侧卵巢,分离优势卵泡（dominant follicles, DF）和从属卵泡（subordinate follicles, SF）;其中3头牛DF和SF分别分离颗粒细胞（granulosa cells, GCs）,抽提总RNA后,经反转录、引物特异性扩增、胶回收及测序,获得AGTR2基因全CDS区;生物信息学方法对其序列结构、亲缘关系及立体结构进行分析;设计AGTR2和内参基因RPLP0 qRT-PCR引物,分析AGTR2在牛DF和SF的差异表达情况;另1头牛DF和SF经4%多聚甲醛固定后,设定阳性、阴性对照组和试验组,应用免疫组织化学技术对AGTR2进行表达和定位分析。【结果】 AGTR2 CDS区全长1 089 bp,编码362个氨基酸;牛卵泡AGTR2氨基酸序列与NCBI数据库获得的其他24种动物对应的氨基酸序列BLAST分析表明,该序列与印度水牛序列相似性最高（99.4%）,与其他动物序列相似性为92.0%—98.9%;立体结构和功能域分析表明,AGTR2立体结构中包含有7个横跨细胞膜的平行的α螺旋结构,符合G蛋白偶联受体（G-protein-coupled receptors, GPCRs）的典型特征;qRT-PCR分析结果表明AGTR2 mRNA在DF的表达量极显著高于SF（P<0.01）,且差异表达倍数达7.47倍;免疫组织化学分析结果表明AGTR2在牛DF和SF颗粒层、膜层细胞均有表达,特异性显色强度表明AGTR2在SF膜层细胞表达量高于DF。【结论】 AGTR2属于G蛋白偶联受体,符合神经肽CART受体的基本特征;本试验为进一步研究AGTR2在牛卵泡发育过程中调控信号通路和激素分泌的机理奠定基础,同时,对后期鉴定CART的受体、深入阐明CART调控牛卵泡发育的作用机理具有重要意义。     

牛ODF2和PDF2转录组测序筛选卵泡发育的相关基因

为研究牛卵泡发育过程中影响卵泡发育的重要调控基因及其表达模式,通过B超声波监测并采集牛卵泡发育波中出现偏差期后的第二大卵泡(ODF2)和偏差期前的第二大卵泡(PDF2),建立卵泡颗粒细胞RNA文库并进行高通量测序;测序结果经数据库搜索和差异表达筛选,采用DAVID软件GO和KEGG通路分析,再经Gene Cards功能查询筛选牛卵泡发育的相关基因.结果表明:转录组测序共获得35 325个基因,其中,高表达基因15 536个,进一步筛选出504个差异表达基因;GO分析表明,504个差异表达基因中参与生物过程的基因占39.49%,细胞组分占46.96%,分子功能占13.55%;KEGG通路分析表明,共有97个差异表达基因通过10条信号通路参与牛卵泡发育调控(P0.05),经Gene Cards进行功能查询后,共筛选出18个与牛卵泡发育密切相关的调控基因.在卵泡发育过程中,PYCARD、MYC、PRICKLE1、TGFBR3、PIK3R3、SOX4、TOPORS、KREMEN1、STK11和NTRK1可能直接参与细胞增殖或凋亡.     

牛卵泡CMKLR1基因CDS区克隆及结构分析

[目的]旨在确定牛卵泡趋化因子样受体1(Chemokine-like receptor 1,CMKLR1)全CDS区序列结构并对其分子特征和三级结构进行预测。[方法]采集正常发育牛卵泡分离颗粒细胞(Granulosa cells,GCs),提取总RNA后反转录,特异性引物扩增、测序,获得全CDS区后生物信息学方法进行结构分析和功能预测。[结果]CMKLR1CDS区全长1 089bp,编码362个氨基酸;蛋白质一级结构中分别包含4个O-糖基化位点、1个N-糖基化位点和50个磷酸化位点;三级结构和功能域分析表明,CMKLR1有7个横跨胞膜的平行的α螺旋结构,属于典型的G蛋白偶联受体。[结论]多糖基化、磷酸化位点的存在以及蛋白定位的特殊性,提示该蛋白功能较为复杂。该研究为后期深入探讨CMKLR1与牛卵泡发育的关系奠定了基础。     

基于Label-free技术分析牛卵泡蛋白质组分及关键调控蛋白

旨在研究牛卵泡发育过程中蛋白质组表达变化并筛选卵泡发育关键调控蛋白,利用非标记(label-free)定量蛋白质组学技术对牛卵泡颗粒细胞(granulesa cells, GCs)蛋白质组分进行比较分析。采集牛发情周期优势卵泡(dominant follicles, DF)和从属卵泡(subordinate follicles, SF),分别分离GCs,并提取总蛋白,胰蛋白酶酶解,液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)进行蛋白质组分分析,数据库检索分析DF和SF中蛋白质表达情况,并应用生物信息学方法筛选牛卵泡发育关键调控蛋白。结果表明:本试验从30 321个肽段中共成功鉴定出3 409种蛋白质(FDR≤0.01),其中,DF中表达2 895种蛋白质,SF中表达3 102种蛋白质,获得差异表达蛋白质(差异倍数>2,P<0.05) 259种,17种差异表达蛋白质可能与牛卵泡优势化过程相关,SERPINB2可能调控牛卵泡闭锁。该研究筛选获得的牛卵泡差异表达蛋白质和特异表达蛋白质,丰富了牛卵泡发育调控理论,为进一步研究卵泡闭锁及优势化奠定基础。     

基于Illumina平台转录组测序筛选牛卵泡发育调控基因

运用超声波监测技术,采集母牛发情期出现偏差前的第一大卵泡PDF1和出现偏差后的第二大卵泡ODF2,分别分离卵泡颗粒细胞(GCs),构建RNA文库,用Illumina2000测序;测序结果经数据库搜索和差异表达筛选,采用DAVID软件GO和KEGG pathway分析,经Genecards功能查询,筛选牛卵泡发育相关基因。结果表明:数据库搜索共获得35 325个基因,其中有意义的表达基因15 645个,从中筛选获得差异表达基因608个;GO分析表明,608个差异表达基因中参与生物过程的基因占60.46%,细胞组分的基因占20.08%,分子功能的基因占11.46%;KEGG pathway分析表明,608个差异表达基因通过9条信号通路参与牛卵泡发育调控(P0.05),经Genecards功能筛选,共获得11个与牛卵泡发育密切相关的调控基因——SESN3、COL3A1、CCNE1、CAV1、CACNA1H、ITPR1、PIK3R3、MYC、PTGFR、CDK6、GAPDH,它们直接参与细胞增殖分化及信号通路调节。     

PDF2和ODF1转录组测序筛选牛卵泡发育相关基因

旨在筛选牛卵泡发育相关基因及其表达模式。本研究选取9头青年母牛,同期发情处理后,采集卵泡波中出现偏差前的小卵泡PDF2(The small follicle at onset of predeviation)和出现偏差后的最大卵泡ODF1(The largest follicle at onset of deviation),分离颗粒细胞(Granulesa cells,GCs),提取总RNA,并进行转录组测序;经牛RefSeq数据库搜索和差异表达基因筛选,进行GO(Gene ontology)分析;随机选择5个基因(MAPK13、CYP19A1、GREB1、SERPINE2、GSTA5)进行qRT-PCR表达量验证分析。结果表明:PDF2和ODF1转录组中共获得RPKM(The reads per kilobase per million reads)值≥0.5的表达基因15 413个,其中表达差异倍数(Fold change)≥2的差异表达基因共651个;对651个差异表达基因进行GO分析表明,参与生物过程(Biological process,BP)的基因占41.66%,分子功能(Molecular function,MF)占17.24%,细胞组分(Cellular component,CC)占41.10%;GO分析结合Genecards基因功能查询,共筛选出13个下调基因和17个上调基因与牛卵泡发育直接相关;CYP19A1、GREB1、SERPINE2在优势卵泡(Donminant follicles,DF)的表达量极显著高于从属卵泡(Subordinate follicle,SF)(P0.01),MAPK13在SF表达量极显著高于DF(P0.01),GSTA5在SF表达量显著高于DF(P0.05)。5个基因差异表达趋势与转录组测序结果完全相符,也进一步证明了转录组测序结果的可信度,为深入探讨基因调控牛卵泡发育奠定了基础。