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利用PCR介导的基因置换技术构建阿维链霉菌bkdF-突变株 总被引:3,自引:1,他引:2
PCR介导的基因置换技术是一种利用λ噬菌体Red重组系统在微生物中进行基因中断的新方法。实验利用该方法快速构建基因中断载体,并成功地置换了阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)bkdF基因。先合成1对长度分别为58和59nt的引物,其5’端的39nt序列分别与bkdF基因两侧同源,3’端则分别与安普霉素抗性标记盒(aac(3)Ⅳ+onT)两侧序列一致。以该引物扩增的PCR产物电转化能表达λRed重组酶且含有目标质粒的大肠杆菌(Eschcrichia.coli)菌株BW25113/pU790/pXW1224,获得了阳性重组质粒pXW1230。将该质粒中的大小为4.0kbBglⅡ目的片段插入基因置换载体pHZl35l,再接合转移至阿维链霉菌BJBM9903,筛选得到表型为Apma^RThio^S的接合子。PCR验证并对发酵产物进行HPLC和MS分析,证实该接合子为敞dkdF^-突变株。 相似文献
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阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)基因组中含有orfX基因,通过增加orfX基因剂量可以提高阿维菌素的产量。本研究以pIJ8600为出发质粒,构建了含红霉素启动子(ermEp*)和orfX结构基因DNA片段的整合型表达载体pWJ827。通过接合转移将pWJ827导入阿维菌素的工业菌株BIB9903中,得到稳定高产的重组菌株BIB0827。高效液相(HPLC)分析结果表明,与出发菌株BIB9903相比,BIB0827发酵产物阿维菌素产量提高了1.5倍,达到3350μg/mL。传代稳定性实验证明,BIB0827传代10代后依然稳定,在工业生产上有较大的应用价值。 相似文献
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BIB0830是将泰乐菌素转化为乙酰异戊酰泰乐菌素(AIV)的耐热链霉菌(Streptomyces thermotolerans)工业菌株。以pIJ8600为载体分别构建了acyB1-B2基因整合型表达载体pBIB425和带红霉素突变启动子ermEp*的红霉素抗性ermE基因整合型表达载体pBIB304。通过大肠杆菌(Escherichia coli)-链霉菌属间接合转移分别将pBIB425、pBIB304和pBIB308(耐热链霉菌的nsdA基因中断载体)导入工业菌株BIB0830,抗性筛选分别得到接合子BIB425、BIB304和BIB308。经PCR验证均为阳性克隆。摇瓶发酵结果表明,与出发菌株BIB0830相比,BIB425和BIB308泰乐菌素转化率分别提高了14%和22%,而BIB304则无明显影响。 相似文献
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肉桂地链霉菌接合转移体系的构建及nsdA基因中断对其次级代谢的影响 总被引:1,自引:1,他引:1
以pSET152和pHL212为出发质粒,通过供体大肠杆菌ET12567(pUZ8002)和S17-1属间接合转移肉桂地链霉菌(Streptomyces cinnamonensis),首次构建并优化了肉桂地链霉菌的接合转移系统。利用PCR介导的基因置换技术快速构建了肉桂地链霉菌nsdA基因 (negative regulator of Streptomyces differentiation)中断载体,通过接合转移导入肉桂地链霉菌工业菌株BIB2005,筛选得到一株遗传稳定表型为AmR、KmS的接合子BIB309。PCR分析结果显示该接合子即为nsdA中断突变株。与出发工业菌株相比,在摇瓶水平上nsdA中断突变株BIB309莫能菌素产能提高了2.7倍。 相似文献
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