miRNA-27b-3p对猪脂肪前体细胞分化的影响

为研究miRNA-27b-3p对猪脂肪前体细胞分化的影响,试验首先对miRNA-27b-3p的靶基因进行预测,然后将miRNA-27b-3p和阴性对照分别转染猪脂肪前体细胞,使用qRT-PCR和ELISA试剂盒检测靶基因在24、48 h转录水平和翻译水平的表达量;甘油三酯检测试剂盒检测脂肪前体细胞中甘油三酯的含量。预测结果显示,miRNA-27b-3p靶向调控影响脂肪沉积的关键基因LPL(脂蛋白酯酶基因);qRT-PCR结果显示,miRNA-27b-3p转染24 h后猪脂肪前体细胞中LPL基因的表达量极显著下调(P<0.01),而转染48 h无明显差异;ELISA结果显示,miRNA-27b-3p转染24 h后猪脂肪前体细胞中LPL蛋白表达量显著下调(P<0.05),转染48 h后猪脂肪前体细胞中LPL蛋白表达受到极显著抑制(P<0.01);甘油三酯检测结果显示,猪脂肪前体细胞中的甘油三酯含量显著降低(P<0.05)。结论：miRNA-27b-3p可以靶向调控LPL基因的表达,抑制猪脂肪前体细胞的分化。     

永生化麝鼠香腺成纤维细胞的转录组学分析

【目的】探索永生化对麝鼠香腺成纤维细胞转录组的影响。【方法】在获得永生化的麝鼠香腺成纤维细胞后,采用二代测序的方法对其永生化前后转录组进行检测,并通过生物信息学方法进行差异分析。【结果】用Trinity软件对麝鼠永生化和原代香腺细胞测序数据进行基因组装,总共发现62 152 unigenes,富集分析结果显示,上述基因主要聚集在细胞代谢、细胞生物学调控、蛋白结合和酶催化等基因的细胞基础代谢活动。基于DESeq2包的基因表达差异分析结果表明,永生化和原代细胞表达差异的基因总共有8 690个,其中上调基因3 414个,下调基因5 276个,上调基因主要富集于DNA复制、同源重组、错配修复、细胞周期和RNA代谢通路,下调基因主要富集于氧化磷酸化、帕金森病和阿尔茨海默病疾病通路中。【结论】永生化过程对麝鼠原代细胞基因的影响较大,可为后续建立永生化香腺细胞体外泌香体系提供理论支撑。     

低温条件下日本医蛭各组织基因表达转录组测序及qPCR验证

为解析日本医蛭(Hirudo nippnica Whitman)繁殖的分子机理,研究不同.温度下饲养的日本医蛭各组织基因表达差异情况.利用转录组学测序检测不同温度饲养条件下日本医蛭肌肉、环带和头部组织的基因表达情况,筛选出11个差异表达基因,并对其进行qPCR验证.qPCR结果显示一种具有去饱和酶功能的膜蛋白编码基因G...     

从江香猪PDK4基因干扰载体的构建与检测

为了进一步揭示PDK4基因在猪肌内前体脂肪细胞中的调控作用,本试验采集5日龄从江香猪背最长肌,采用Ⅱ型胶原酶进行消化,分离肌内前体脂肪细胞,进行原代和传代培养及形态学观察;根据克隆得到的PDK4基因序列,利用在线软件设计合成3对特异性单链siRNA序列和1对阴性对照序列,经退火后形成双链,连接pLVX-shRNA2-Puro载体,重组质粒采用双酶切及测序进行验证。针对干扰载体转染培养的从江香猪肌内前体脂肪细胞,采用实时荧光定量PCR方法筛选出最有效的干扰序列。结果显示,原代从江香猪肌内前体脂肪细胞约4h开始贴壁,24h后细胞形态均一,贴壁牢固,第5天汇合呈单层细胞,基本铺满培养板;重组质粒经双酶切及测序鉴定结果显示,设计合成的4对siRNA干扰序列与载体质粒均连接正确,表明成功构建了PDK4基因的干扰载体,并可成功转染猪肌内前体脂肪细胞;实时荧光定量PCR方法检测发现,干扰载体可有效减少从江香猪肌内脂肪前体脂肪细胞中PDK4基因mRNA的表达,最佳干扰效率可达81.90%。本试验成功培养了从江香猪肌内前体脂肪细胞,构建并得到了PDK4基因的最佳干扰载体,为进一步研究PDK4基因对脂肪代谢的调控机制奠定基础。     

从江香猪miR-143-3P克隆及组织表达

为探究miR-143-3P对从江香猪的表达调控作用,本研究通过SWChen 2.3程序筛选出PRKAA1基因3'-UTR相关的miRNAs,利用生物信息学软件分析其保守性,采用茎环法设计引物克隆miR-143-3P序列,运用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测该miRNA在从江香猪各组织中的表达水平.结果表明:...     

从江香猪PDK4基因干扰载体的构建与检测

为了进一步揭示PDK4基因在猪肌内前体脂肪细胞中的调控作用,本试验采集5日龄从江香猪背最长肌,采用Ⅱ型胶原酶进行消化,分离肌内前体脂肪细胞,进行原代和传代培养及形态学观察;根据克隆得到的PDK4基因序列,利用在线软件设计合成3对特异性单链siRNA序列和1对阴性对照序列,经退火后形成双链,连接pLVX-shRNA2-Puro载体,重组质粒采用双酶切及测序进行验证。针对干扰载体转染培养的从江香猪肌内前体脂肪细胞,采用实时荧光定量PCR方法筛选出最有效的干扰序列。结果显示,原代从江香猪肌内前体脂肪细胞约4 h开始贴壁,24 h后细胞形态均一,贴壁牢固,第5天汇合呈单层细胞,基本铺满培养板;重组质粒经双酶切及测序鉴定结果显示,设计合成的4对siRNA干扰序列与载体质粒均连接正确,表明成功构建了PDK4基因的干扰载体,并可成功转染猪肌内前体脂肪细胞;实时荧光定量PCR方法检测发现,干扰载体可有效减少从江香猪肌内脂肪前体脂肪细胞中PDK4基因mRNA的表达,最佳干扰效率可达81.90%。本试验成功培养了从江香猪肌内前体脂肪细胞,构建并得到了PDK4基因的最佳干扰载体,为进一步研究PDK4基因对脂肪代谢的调控机制奠定基础。     

从江香猪lncGHR1基因的克隆、组织表达及超表达研究

目的预测靶向林麝(Moschus berezovskii) FASN、HMGCR和CYP11A1基因的miRNAs,为麝香的生物合成机制研究提供参考。方法通过林麝麝香的代谢组学测序,获取麝香中的主要化学组分,确定相应化学组分合成的关键酶;通过转录组测序获取林麝基因mRNA序列及miRNAs序列,利用自主编写的离线SWChen系统对调控关键酶基因表达的miRNA进行预测,并以人FSAN基因对系统准确性进行验证,同时以牛(Bos taurus)、山羊(Capra hircus)和绵羊(Ovis aries)预测结果进行比较和集合论分析,获取调控林麝基因的候选miRNAs。结果麝香的化学成分主要包括脂肪酸碳链类衍生物、芳香族、固醇类和甾类等衍生物质;预测调控FASN基因表达的miRNA主要为miR-24-3p和miR-30b-3p,调控HMGCR基因表达的为miR-29b、miR-146a、miR-181b-3p和miR-429家族,调控CYP11A1基因表达的为miR-532-3p和let-7家族,共同调控3个基因表达的主要为miR-205家族和miR-143家族。结论上述miRNAs为靶向调控林麝FASN、HMGCR和CYP11A1基因表达的候选miRNAs,对解析林麝麝香的生物合成机制具有参考价值。