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【目的】阐明蜡样芽孢杆菌NJSZ-13中杀线蛋白酶ATP-α与ClpX的杀线分子机制,构建杀线蛋白酶ATP-α与ClpX的原核表达载体。【方法】克隆杀线蛋白酶编码基因atpA与clpX,利用基因工程手段对杀线蛋白酶编码基因进行PCR扩增,并与载体pET-21b连接构建重组载体,提取重组质粒转入蛋白表达载体大肠杆菌BL21(DE3)。利用菌落PCR和测序验证转化效果。加入IPTG诱导蛋白表达,使用Ni-NTA柱进行重组蛋白的纯化,利用SDS-PAGE与Western blot验证ATP-α与ClpX纯化效果并进行杀线活性测定。【结果】菌落PCR验证和测序表明,重组载体中含有蛋白酶编码基因atpA与clpX,且基因序列与参考序列一致,证明目的基因已经成功插入BL21(DE3)表达载体中。SDSPAGE与Western blot验证表明,重组蛋白得到正确诱导与纯化,成功构建杀线蛋白酶ATP-α与ClpX的原核表达载体。杀线活性测定结果表明ATP-α与ClpX均具有较强的杀线效果。ATP-α在72 h达到66.75%的杀线率,ClpX在72 h达到75.46%的杀线率。同时,两个蛋白酶共同作用... 相似文献
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蜡样芽胞杆菌NJSZ-13对松材线虫有较高的致死作用。为了明确蜡样芽孢杆菌NJSZ-13对松材线虫的致死因子，探讨了蜡样芽胞杆菌NJSZ-13对松材线虫的作用机制。首先将NJSZ-13菌悬液处理的松材线虫体表彻底消毒并研磨后涂含青霉素的抗性平板，并通过荧光显微镜观察线虫虫体上含gfp荧光质粒的NJSZ-13菌体以明确菌株在线虫虫体上的存在位置。然后测定菌株与松材线虫混合后上清液及其中胞外蛋白粗提物的杀线活性，并测定虫菌混合液的吸光度，观察菌体繁殖量的变化。结果表明：松材线虫体表彻底消毒研磨后涂布抗性平板未长出菌落，且在松材线虫体表观察到菌株NJSZ-13。菌株与松材线虫混合并静置48 h后，其上清液无显著杀线活性。菌株与松材线虫混合并摇培4 d后，上清液中胞外蛋白粗提物浓缩10倍后具有较高的杀线活性，处理松材线虫48 h后的松材线虫死亡率达到66.23%。粗提物经沸水浴30 min后处理松材线虫，线虫死亡率显著降低，处理48 h后松材线虫死亡率仅有23.88%。菌株与松材线虫混合并摇培1 d后，虫菌混合液的吸光度开始显著高于菌液的吸光度，此后两者吸光度下降明显，摇培2至10 d期间，虫... 相似文献
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为进一步弄清细菌在松材线虫病中的作用,探明甲氨基阿维菌素苯甲酸盐和抗生素联合应用防治松材线虫病的效果,从松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)携带的细菌中筛选出能显著促进松材线虫存活、繁殖和加重病害发生的菌株,通过药敏试验,在30种抗生素中筛选出对病害相关细菌有较强抑菌活性的高效抗生素,研究甲维盐(甲氨基阿维菌素苯甲酸盐)对松材线虫携带致病细菌的抑制作用,并将高效抗生素和甲维盐混合,采用浸渍法测定混合液对松材线虫的毒杀性以及采用灌根法测定混合液对6月生马尾松苗(Pinus massoniana)松材线虫病防治效果。结果显示,相比菌株AMA3-2和AMA3-3,菌株AMA3-1对松材线虫的存活、繁殖和病害发生方面具有更好的促进作用。环丙沙星和米诺环素对AMA3-1有较好的抑菌活性,而甲维盐对AMA3-1没有抑制作用。当混合液或甲维盐质量浓度为500 mg/L时,松材线虫的致死率可达80%以上。不同浓度的高效抗生素处理下,松材线虫的校正死亡率维持在较低水平(0.74%～2.43%)。当药剂质量浓度是500mg/L时,在混合接种松材线虫和菌株AMA3-1前2 d及当... 相似文献
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