黄鳝转铁蛋白基因的克隆及其N-lobe的重组表达

以黄鳝（Monopterus albus）肝脏c DNA为模板,利用RACE-PCR扩增了黄鳝转铁蛋白Tf基因5’和3’c DNA末端,构建了Tf基因N端原核表达载体;转化大肠杆菌（Escherichia coli）BL21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导后经过Ni-NTA His·Bind Resin亲和柱分离纯化获得Tf-N蛋白;利用琼脂糖扩散抑菌圈法验证Tf-N蛋白的抑菌作用;分析了Tf-N蛋白对黄鳝肠道假单胞杆菌（Pseudomonas spp.）铁获取作用的影响。结果显示：成功克隆了黄鳝Tf基因全长,构建了pET28a/Tf-N重组表达载体,获得了纯化的Tf-N蛋白;Tf-N蛋白可抑制假单胞杆菌的生长,能与假单胞菌来源的Bfr蛋白一起共同促进假单胞杆菌的生长。该研究结果可为进一步探索鱼类Tf基因的功能提供参考。     

黄鳝肠道假单胞杆菌铁蛋白基因的克隆及融合表达

细菌铁蛋白(bacterioferritin,Bfr)在细菌铁代谢过程中具重要作用。为分析黄鳝肠道假单胞杆菌铁蛋白基因Bfr的功能,以该菌基因组DNA为模板,PCR扩增Bfr基因后将其克隆到pGEX-4T-1表达载体中。序列测定后转化大肠埃希菌BL21(DE3),经IPTG诱导、GST-resin纯化柱分离纯化获得Bfr蛋白。用SDS-PAGE电泳及Western blot检测融合蛋白;用比色法检测融合蛋白的铁离子螯合能力,用液体培养法分析重组蛋白对假单胞杆菌生长的影响。实验结果表明:成功获得黄鳝肠道假单胞杆菌Bfr基因,并实现了Bfr基因的融合表达;带有融合标签的GST-Bfr蛋白与Fe³⁺和Fe²⁺均不能结合,而Bfr蛋白则可以结合Fe³⁺但不能结合Fe²⁺;在外源添加Fe³⁺情况下,重组Bfr蛋白可促进假单胞杆菌的营养生长。该研究为进一步深入了解假单胞杆菌铁蛋白基因的功能提供了参考资料。