单增李斯特菌谷氧还蛋白Grx负调控渗透转运系统OpuC转录

旨在通过构建单增李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)谷氧还蛋白(glutaredoxin,Grx,由lmo2344编码)的基因缺失株以研究其与渗透转运系统(OpuC)相关基因转录的调控关系.LM基因缺失株采用本实验室已建立的同源重组方法构建并筛选获得.利用实时荧光定量PCR(RT-PCR)和绿...     

单核细胞增生李斯特菌精氨酸脱亚胺酶基因的克隆及原核表达

精氨酸脱亚胺酶(ADI)可能介导单核细胞增生李斯特菌抗酸应激,由arcA基因编码。利用分子克隆技术从单核细胞增生李斯特菌10403S扩增得到ADI基因,测序正确后将其插入pET30a表达载体中,构建该基因的原核表达质粒pET30a-ADI,并转化入大肠埃希菌Rosetta中进行诱导表达。核苷酸序列分析显示,ADI基因的完整开放阅读框为1 233 bp,编码410个氨基酸。SDS-PAGE表明:该基因在大肠埃希菌中成功表达,重组蛋白的分子质量约为52.5 ku。为进一步研究精氨酸脱亚胺酶的活性提供了条件,同时也为探索单核细胞增生李斯特菌抗酸应激的机理奠定了重要的基础。     

核酸适体检测赭曲霉毒素A荧光方法的建立

赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)普遍存在于谷物等粮食和动物饲料中,是一种可以引起癌症的霉菌毒素。为了快速检测OTA,利用荧光染料PicoGreen识别双链DNA原理,建立了一种基于核酸适体与PicoGreen检测毒素OTA的方法。在10 mmol/L Tris,120 mmol/L Na Cl,5 mmol/L KCl,20 mmol/L CaCl2(pH8.5)缓冲液中,PicoGreen与双链DNA结合后,释放的荧光在3 min内达到峰值(激发波长为480 nm,发射波长为520 nm)。从加样到荧光检测,整个流程可在40 min内完成。检测OTA的灵敏度为1μg/L;检测范围为1μg/L~200μg/L。特异性实验表明:OTA核酸适体-Pico Green方法与黄曲霉毒素B1、伏马毒素B1、桔毒素和玉米赤霉烯酮等霉菌毒素无交叉反应。本方法在检测敏感性和特异性方面与传统抗体ELISA方法相当(Kappa值为:0.857)。由于核酸适体成本比抗体低,因此本方法比抗体ELISA方法更具实用价值。     

单增李斯特菌plcB缺失株的生物学特性及酵母双杂交诱饵载体构建

为探究单增李斯特菌磷脂酶PlcB在细菌感染过程中的作用及挖掘可能与宿主互作的相关蛋白,本试验利用李斯特菌遗传操作系统构建了 plcB缺失回补株及基于PlcB为诱饵的酵母双杂交系统,并通过体外生长曲线、细胞内增殖试验、空斑形成能力等试验研究PlcB介导的生物学功能;通过酵母双杂交诱饵质粒自激活及毒性试验和诱饵蛋白表达检测...     

单增李斯特菌内化素家族蛋白的研究进展

单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)是一种革兰阳性病原菌,是食源性李斯特菌病的病原体,在免疫力低下的人和动物中能够引起高死亡率.该菌致病的关键是其能在非吞噬细胞发生内化作用并在其中存活.内化素家族蛋白(internalins)在单增李斯特菌感染过程中起着至关重要的作用,该族蛋白是一组以...     

滋阴益气活血组方对STZ糖尿病模型大鼠糖代谢的影响

为探讨滋阴益气活血组方对链脲佐菌素(STZ)糖尿病大鼠糖代谢的影响,用STZ尾静脉注射45 mg/kg诱导建立糖尿病大鼠模型,将符合糖尿病诊断标准的大鼠,随机分为模型对照组(n=15)和组方治疗组(n=15)。同时设立正常对照组(n=20)。组方治疗组灌胃滋阴益气活血组方水煎液10 mL/kg.d,模型对照组和正常对照组灌胃相当剂量的生理盐水,灌胃期为56 d。灌胃第14、28、42、56天眶后静脉丛采血,离心制备血清以测血糖(GLU),第56天测血清糖化血清蛋白(GSP),处死大鼠取肝脏测肝糖原的含量。用组方治疗组水煎液连续灌胃8周后,该组大鼠的体重相对于模型对照组处于上升趋势;第56天时,血糖极显著低于模型对照组(P0.01),基本接近正常水平;糖化血清蛋白含量极显著低于模型对照组(P0.01),肝糖原含量极显著高于模型对照组(P0.01)。滋阴益气活血组方能够改善和纠正糖尿病大鼠糖代谢的异常,对临床研究中药治疗糖尿病具有指导意义。     

单核细胞增生李斯特菌溶血素hly基因缺失株和回补株的构建

单核细胞增生李斯特菌(简称单增李斯特菌)为革兰染色阳性菌,在人类与动物生活环境中均广泛分布,为人畜共患病原菌。李斯特菌溶血素O(LLO,由hly编码)作为李斯特菌重要毒力因子主要在细菌裂解并逃逸吞噬体中起作用,但其潜在的分子机制尚待深入解析。以单增李斯特菌EGD-e为参考菌株,通过PCR分别扩增hly基因的上、下游同源臂序列(各约500bp),选用SOE PCR方法将同源臂整合连接成融合片段。经BamHⅠ/SalⅠ酶切、连接后克隆至李斯特菌温敏型穿梭质粒pKSV7中得到重组质粒pSL081,测序验证后电转至EGD-e感受态细胞中,在温度变化及抗生素双重选择压力下筛选获得hly基因缺失株Δhly。同时,设计引物扩增含hly基因启动子和编码区序列的片段,克隆至李斯特菌整合型质粒pIMK2中得到重组质粒pSL251,测序验证后电转至缺失株Δhly感受态细胞中,经抗性筛选获得回补株CΔhly。测序结果显示,缺失株Δhly和回补株CΔhly均构建正确。利用Western blot方法检测突变株中LLO的表达情况,结果显示EGD-e和CΔhly中均能检测到LLO的正常表达,而Δhly中无法检测到,进一步证实成功构建了hly基因缺失株和回补株,为下一步深入探索LLO在李斯特菌感染过程中的生物学功能奠定了基础。     

单核细胞增多性李斯特菌硫氧还蛋白TrxA调控磷脂酶PlcB研究

细菌中的硫氧还蛋白A(thioredoxin A,TrxA)能够通过对氧化受损的的二硫键进行修饰进而参与蛋白质的正确折叠。磷脂酶PlcB作为单核细胞增多性李斯特菌(Listeria moncoytogenes)关键的毒力因子在细菌逃逸吞噬体过程中起重要作用,但该蛋白是否受李斯特菌TrxA的修饰尚无报道。因此,本试验主要从转录和蛋白表达水平以及蛋白活性水平研究李斯特菌硫氧还蛋白TrxA对磷脂酶PlcB的调控关系。结果显示,单增李斯特菌野生株EGD-e缺失trxA基因后,PlcB的转录及蛋白表达水平显著降低,且利用天然启动子回补trxA后能够使PlcB的表达恢复至野生株水平,而组成型启动子回补效率较低,表明TrxA能够严谨调控李斯特菌毒力因子PlcB的表达。体外溶脂试验发现李斯特菌缺失trxA后导致其溶脂能力显著降低,磷脂酶活性检测发现重组PlcB的活性高度依赖TrxA的存在。本研究首次发现并证实李斯特菌PlcB的转录和表达及其磷脂酶活性维持受TrxA的调控,研究结果为深入解析李斯特菌硫氧还蛋白系统在细菌感染宿主过程中的氧化还原修饰机制奠定了理论基础。     

滋阴益气活血组方对STZ糖尿病大鼠免疫器官影响

目的:探讨自拟滋阴益气活血组方对链脲佐菌素(STZ)糖尿病大鼠免疫器官影响。方法:用STZ尾静脉注射45mg/kg诱导建立糖尿病大鼠模型,将符合糖尿病诊断标准的大鼠随机分为模型对照组(n=15)和组方治疗组(n=15),同时设正常对照组(n=20)。组方治疗组灌胃滋阴益气活血组方水煎液10mL/kg.d,模型对照组和正常对照组灌胃相同剂量的生理盐水,连续灌胃56d。灌胃第14、28、42、56天眶后静脉丛采血,制备血清以测定血糖(GLU)水平。第56天剖杀大鼠,取脾脏、胸腺组织,制作切片,观察组织结构。结果:第56天时,组方治疗组的血糖水平极显著低于模型对照组(P0.01),基本接近正常水平;与模型对照组相比,组方治疗组可显著提高脾脏指数和胸腺指数;模型对照组脾小结数量较少,生发中心不够明显;组方治疗组脾小结数量体积较正常,可以见到生发中心;模型对照组胸腺组织结构变化明显,胸腺小体数量较少;治疗组胸腺小叶较大,胸腺小体较多。结论:自拟滋阴益气活血组方能够降低糖尿病大鼠的血糖,对STZ糖尿病大鼠的脾脏、胸腺及其组织结构损伤有一定的治疗作用。     

基于侧向层析原理的赭曲霉毒素A快速检测试纸条的研制

针对霉菌毒素精准检测技术的开发对于保障食品安全至关重要。利用胶体金与赭曲霉毒素A单抗偶联物和赭曲霉毒素A-BSA偶联物（OTA-BSA）,开发了一种快速检测赭曲霉毒素A的方法。研究结果表明:①当OTA-BSA配制终质量浓度为4.8 g·L-1,质控线用羊抗鼠IgG配制终质量浓度为1.5 g·L-1,硝酸纤维素（NC）膜的包被量为1.0 μL·cm-1时呈现最清晰、最均匀的条带。②赭曲霉毒素A胶体金快速检测试纸条的灵敏度达到1.0 μg·L-1,检测时间仅为5 min,非常适合现场快速检测。该检测试纸条具有携带方便、灵敏度高、特异性强等优点。由于本方法检测时间短,灵敏度高,与传统的仪器和酶联免疫检测方法相比,在野外和临床检测中更具有推广应用价值。图5表1参12