铜绿丽金龟气味结合蛋白AcorOBP11的表达纯化及功能分析

【目的】通过研究铜绿丽金龟（Anomala corpulenta）气味结合蛋白11（odorant binding protein 11,OBP11）与寄主植物挥发物的结合特性,探讨AcorOBP11的功能,为阐明铜绿丽金龟识别寄主植物的嗅觉分子机制打下基础。【方法】设计特异性引物,通过RT-PCR克隆AcorOBP11,分析其序列特征并与相似序列进行对比;将目的基因OBP11连入原核表达载体pET28a后,重组质粒转入大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)。利用IPTG诱导AcorOBP11重组蛋白的表达,超声破碎菌体,取上清液过镍柱,利用重组肠激酶切除His标签后再次过镍柱纯化获得目的蛋白;纯化后的蛋白以1-NPN为荧光探针开展荧光竞争结合试验,测定AcorOBP11蛋白与37种寄主植物挥发物的结合特性;利用Modeller对AcorOBP11进行同源建模,以冈比亚按蚊气味结合蛋白AgamOBP48（PDB ID：4ij7）作为模板,获得其三维结构;利用Autodock半柔性对接将蛋白与化合物对接,模拟AcorOBP11与6种候选寄主植物挥发物的结合情况。【结果】克隆获得了AcorOBP11全长基因,开放阅读框共639 bp,N末端有17个氨基酸组成的信号肽,具有8个保守的半胱氨酸位点,属于Plus-C OBP亚家族,进化树结果表明其与HparOBP9进化关系最近。AcorOBP11成功连入pET28a表达载体,在0.25 mmol·L^-1 IPTG、37℃条件下诱导表达,并通过两次镍柱纯化得到目的蛋白。竞争结合试验结果表明,AcorOBP11结合谱较广,对α-紫罗兰酮、异戊醛、丙烯酸-2-乙基己酯、乙酸龙脑酯、柠檬烯、反-2-己烯醛、2-乙基己醛、异戊酸等13种寄主植物挥发物有较好的结合能力。其中,与寄主植物挥发物α-紫罗兰酮结合能力最好,竞争解离常数为22.78 μmol·L^-1。构建了AcorOBP11三维结构图并进行蛋白构象评估后,与6种化合物进行分子对接,结果表明AcorOBP11与α-紫罗兰酮结合自由能最低,为-24.74 kJ·mol^-1,表明其与α-紫罗兰酮的结合能力最强,与荧光竞争结合结果一致;从对接图还可以看出,α-紫罗兰酮不仅与AcorOBP11在Cys163处形成氢键,而且其疏水端进入了蛋白的疏水腔,两个甲基与蛋白表面高度契合,因此,α-紫罗兰酮与蛋白间结合能力最强。【结论】AcorOBP11能够识别多种寄主植物挥发物,推测其在铜绿丽金龟成虫定位寄主植物中发挥重要作用,此研究结果为生态防控铜绿丽金龟提供了新思路。     

二氧化碳在华北大黑鳃金龟幼虫定位寄主植物根系中的作用

为探究二氧化碳(CO2)在华北大黑鳃金龟Holotrichia oblita幼虫定位寄主植物根系时所发挥的作用,对其开展了触角电位生理反应及行为生测试验.研究结果表明,CO2浓度为0.75％、1.5％、3％、6％时均能显著激发幼虫的触角电位和趋性反应,且随着浓度增加幼虫对CO2的趋向爬行所用时间显著缩短;根系分泌物同样...