毛竹阿拉伯糖-5-磷酸异构酶的基因克隆、原核表达及纯化

毛竹Phyllostachys edulis阿拉伯糖-5-磷酸异构酶（PeKdsD）是2-酮-3-脱氧辛糖酸（KDO）生物合成途径的第1个关键酶。采用逆转录实时聚合酶链式反应（qRT-PCR）克隆得到毛竹KdsD基因。该基因cDNA全长1 038 bp,编码346个氨基酸;对不同物种来源的KdsD氨基酸序列进行比对和系统进化树分析。结果表明:毛竹的KdsD与玉米Zea mays等植物来源的KdsD有很高的序列一致性,而与微生物来源的KdsD序列一致性较低。毛竹不同组织实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）结果表明:PeKdsD基因在叶中表达量远远高于其他组织。在大肠埃希菌Escherichia coli原核表达系统中获得了KdsD的可溶性高表达蛋白,将大量表达的重组蛋白经过Ni-NTA亲和层析和分子筛层析（SEC）进行纯化,发现KdsD在溶液（30 mmol·L-1三羟甲基氨基甲烷pH 8.0,200 mmol·L-1氯化钠）中以多种聚体的形式存在;酶学性质测定的结果表明:毛竹KdsD酶最适pH值为pH 8.5,最适作用温度为37℃。此结果为后期研究植物KdsD蛋白的结构与功能奠定了基础。图7参17     

毛竹KDO8PS的原核表达纯化及晶体生长

3-deoxy-D-manno-octulosonate(KDO)8-phosphate synthase(KDO8PS)[EC 4.1.2.16]是KDO生物合成途径中的关键酶。采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,以毛竹Phyllostachys edulis新鲜实生苗为材料,分离得到竹子KDO8PS基因。通过对不同物种来源的KDO8PS进行氨基酸序列比对分析和半定量RT-PCR技术对该基因进行组织特异性表达分析。将PeKDO8PS基因构建入原核表达载体pET-28a,并在大肠埃希菌Escherichia coli原核表达系统中获得了KDO8PS的可溶性高表达。经nickel亲和层析和分子筛纯化2种方法对表达蛋白进行纯化。结果分析表明:该基因编码区全长876 bp,可编码291个氨基酸。PeKDO8PS与拟南芥Arabidopsis thaliana等植物来源的KDSA2的基因有很高序列一致性,而与微生物来源的KDO8PS序列一致性较低。分析毛竹各组织中KDO8PS基因的表达结果表明,该基因在根、茎和叶片中均有表达,但在根中相对表达量较高,此表达模式亦同拟南芥AtKDSA2类似。另外,发现KDO8PS在溶液(30 mmol·L-1Tris-HCl pH 8.0,200 mmol·L-1氯化钠)中以二聚体的形式存在,并且初步筛选出该酶晶体生长条件。此结果为PeKDO8PS蛋白的最终结构分析奠定了基础。