猪源PIV5毒株的全基因组序列测定及其生长特性研究

副流感病毒5型(PIV5)是一种副黏病毒,能感染包括人、猪、牛、马、小熊猫、东北虎等在内的多种哺乳动物而没有明显的致病性.近年来,在我国多个地区和省份从多种动物体内分离到该病毒.参照PIV5 ZJQ-221株全基因组序列设计覆盖HLJ2015/DP2-1/PIV5株(GenBank登录号为MT890697)、JX/12...     

猪盖塔病毒感染性克隆构建及病毒拯救

为研究盖塔病毒(GETV)致病机制,需搭建可靠的盖塔病毒(GETV)反向遗传操作平台。首先构建GETV/HuN1株的全长感染性克隆质粒,并在nsP4基因与C基因之间或E1基因与3′UTR之间插入亚基因组启动子26S和报告基因EGFP,将3个重组质粒分别转染至BHK-21细胞中,拯救病毒,鉴定重组病毒和外源基因稳定性,测定病毒滴度并绘制生长曲线。以重组质粒pACYC-177-GETV为模板进行RT-PCR扩增,结果显示,GETV每个蛋白基因均能正确扩增出相应条带。IFA鉴定结果显示,E2与6K蛋白抗体能与rGETV特异性结合。将EGFP基因分别插入到C基因的上游或E1基因的下游,产生报告病毒rGETV-EGFP/C和rGETV-EGFP/E1。在2种报告病毒感染的BHK-21细胞上均能观察到EGFP高表达,将报告基因插入E1基因下游,可保持其更高的稳定性。此外,生长曲线显示,重组病毒具有与亲代病毒相似的生长速度。综上,GETV反向遗传操作平台的成功建立为研究GETV蛋白功能和研发疫苗奠定了基础。     

猪δ冠状病毒NS7蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定

猪δ冠状病毒(PDCoV)是1种新型猪冠状病毒,该病毒对各年龄段的猪均易感,尤其是对新生仔猪具有较高的致病性,可引起严重腹泻和高病死率。为获得抗PDCoV NS7和NS7a蛋白的单克隆抗体,先以PDCoV-GX2021-1毒株为模板扩增目的基因并构建原核表达载体,经IPTG诱导表达和SDS-PAGE切胶洗脱方法纯化目的蛋白。再按照免疫程序免疫小鼠并运用间接免疫荧光试验检测小鼠血清中特异性抗体;将血清阳性的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合后进行亚克隆筛选,获得1株可持续传代并产生抗NS7和NS7a蛋白抗体的单克隆杂交瘤细胞(命名为1-A08)。运用间接免疫荧光试验鉴定该单抗可特异性标记PDCoV感染细胞,Western blot和IP试验发现该单抗可特异性结合NS7和NS7a蛋白。此外,通过Western blot试验鉴定出该单抗的B细胞线性表位为₁₁₁PSTLEED₁₁₇。将该单抗的抗原表位序列与NCBI中发布的168株PDCoV NS7蛋白这一区域的氨基酸序列进行比对分析,发现该单抗的抗原表位较为保守,与其中160株的氨基酸序列一致。     

表达PEDV S蛋白重组仙台病毒的构建及其免疫原性研究

为构建表达猪流行性腹泻病毒(PEDV) S蛋白的重组仙台病毒(SeV),并评价其诱导的特异性免疫应答反应,利用PCR扩增得到PEDV中国流行株的全长S基因,构建含S基因的重组仙台病毒感染性克隆质粒(pBeloBAC-SeV-PEDV-S),并拯救重组病毒SeV-PEDV-S。对重组病毒进行鉴定并测定其生长曲线以确定成功获得表达PEDV S蛋白的重组仙台病毒。将表达S蛋白的仙台病毒免疫小鼠;间接免疫荧光和Western blot试验检测血清中特异性抗体的产生;利用脾脏淋巴细胞分离和流式细胞技术检测特异性T淋巴细胞增殖反应;对血清中的中和抗体效价进行评价。结果表明：重组仙台病毒能特异性表达PEDV S蛋白,且与野生型仙台病毒有一致的生长曲线;免疫小鼠后,重组仙台病毒能有效刺激小鼠产生特异性抗体,诱导较高的中和抗体水平,且能显著促进PEDV特异性T淋巴细胞增殖。综上,该试验为进一步研究重组仙台病毒在猪体上的免疫反应奠定了基础,也为新一代安全有效的PEDV活载体疫苗的研发提供了策略。     

盖塔病毒E2蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位鉴定

为制备盖塔病毒(GETV) E2蛋白单克隆抗体,通过大肠埃希菌表达系统表达重组E2蛋白,经过镍柱吸附、切胶纯化,获得E2蛋白,将其作为免疫原免疫BALB/c小鼠,3次免疫后加强免疫,细胞融合,通过间接免疫荧光筛选阳性杂交瘤细胞,最终筛选出1株针对GETV E2蛋白的阳性杂交瘤细胞9E8,将该杂交瘤细胞注射入小鼠腹腔内生产腹水。经间接免疫荧光试验和蛋白免疫印迹试验鉴定,该单抗可与GETV发生特异性反应。经IP试验证明,该单抗可识别天然结构的GETVE2蛋白。对E2单抗进行抗原表位鉴定,确定其所识别的多肽序列为⁶⁶KIRYIAGHD⁷⁴。与GenBank上登录的其他GETV毒株序列对比,发现该段序列高度保守。综上,E2单抗9E8免疫学反应特性良好,为研究该病毒提供了有效的免疫学检测工具。     

猪萨佩罗病毒VP1蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定

猪萨佩罗病毒(PSV)是一种小RNA病毒,在临床上多与猪流行性腹泻病毒、捷申病毒等引起混合感染.近年来,我国多个省份报道在猪体内分离到该病毒,因而有必要加强对PSV的相关研究.参照PSV-HuN2株序列,将VP1基因插入pGEX-6p-1中进行重组蛋白表达.将蛋白质溶液与弗氏佐剂混合,按照标准程序免疫6～8周龄BALB...