大蒜遗传转化体系建立与CRISPR-Cas9敲除蒜氨酸酶基因研究

为了为大蒜转基因研究和蒜氨酸酶基因研究提供技术支撑和理论依据,本文首先建立了愈伤组织再生培养体系,在基因型、生长发育时期、植物激素配比和外植体来源方面对比MS、B5、N6和SH基础培养基,明确大蒜愈伤诱导和培养的最适基础培养基为MS和SH,其中以苍山大蒜根尖为外植体、培养基为MS+1 mg/L 2,4-D+0.1mg/L 6-BA是大蒜愈伤组织诱导的最佳组合;分化阶段为MS+3 mg/L 6-BA;生根培养和鳞茎诱导阶段则使用不添加任何激素的培养基。然后,通过对影响农杆菌介导遗传转化因素的筛选,得到最佳转化条件：农杆菌菌株选用LBA4404、侵染液组成MS/LB+100μM As+1%葡萄糖+1%蔗糖为宜,侵染时间10 min,共培养3 d,草铵膦筛选浓度为250 mg/L,在此条件下该方法的遗传转化率为1.68%。利用CRISPR-Cas9敲除技术,成功实现了对鳞茎蒜氨酸酶关键基因的敲除,突变体中目的基因m RNA的表达量和蒜氨酸酶活均明显下降。