甲基-β-环化糊精对猪体外受精及早期胚胎发育的影响

为了优化猪体外受精技术体系,本试验探索了甲基-β-环化糊精(methyl-beta-cyclic dextrin,MBCD)对猪体外受精以及早期胚胎发育的影响。在体外受精0和4 h向受精液(modified Tris-buffered medium,mTBM)中添加不同浓度(0,0.5,1,2,5,10,15,20μmol/mL)的MBCD,受精孵育结束后转至PZM-3培养液中进行胚胎培养。对各处理组卵母细胞的受精情况以及胚胎发育能力进行了系统的检测,并用金霉素(chlortetracycline,CTC)染色法评估了MBCD处理后精子获能状态。结果显示:1)体外受精0 h添加5μmol/mL MBCD组的卵裂率、囊胚率、囊胚细胞数显著高于(P<0.05)对照组和除10μmol/mL MBCD组之外的其他试验组。2)体外受精0 h添加5和10μmol/mL MBCD组、单精入卵率显著高于(P<0.05)对照组和其他试验组,而多精入卵率显著低于(P<0.05)对照组和其他试验组。3)添加5μmol/mL MBCD组,0～1 h,F型精子迅速减少(78.56～19.43),B型精子迅速增加(10.79～69.86);1～4 h,F型精子和B型精子基本保持不变(B型:69.86～78.78,F型:19.43～9.11)。上述结果表明在体外受精0 h向mTBM中加入5μmol/mL MBCD可以显著提高获能精子比例,减少多精受精发生,提高早期胚胎发育潜能。     

仓方早生桃树人工辅助授粉方法

桃品种仓方早生适应性广、结果早、果个大、硬溶质、口感好、耐贮运、市场售价高,但是花粉败育、坐果率低,采用人工辅助授粉方法可显著提高坐果率,保证桃树高产、稳产.     

精子介导的转基因效率关键影响因素

【目的】精子介导的转基因技术简单易行,其作为制备转基因动物的一种方法已经被很多科学家所认同。但是不同实验室的研究结果显示其稳定性和重复性较低,转基因效率差异极大。现将主要探讨导致这种现象的原因。【方法】小鼠精子获能后分别与0、15、30和300nmol·L^-1 的Cy-3标记DNA（Cy-3-DNA）在37℃共孵育30 min。其后,血细胞计数板检测小鼠精子的活率;共孵育精子进行直接涂片,DPBS洗涤后涂片,DnaseI消化后涂片,精子涂片置于荧光显微镜下,记录视野中的精子总数及显示Cy-3信号的精子数,用于统计精子结合及内化DNA的效率。精子与300 nmol·L^-1 的Cy-3-DNA共孵育后,以50µmol·L^-1的 P₄诱导精子顶体反应,统计顶体反应前后显示Cy-3信号的精子比例。精子分别与15和300 nmol·L^-1 Cy-3-DNA共孵育后,精子进行体外受精,在荧光镜下观察合子期受精卵中Cy-3-DNA的存在位置。按照优化后的条件,精子分别与0、15和300 nmol·L^-1 pEGFP-C1质粒共孵育后进行体外受精,制备转基因胚胎。比较试验组和对照组的受精率和发育效率,采用PCR和RT-PCR方法检测囊胚期外源基因整合和表达情况。【结果】获能后的精子分别与0、3、15、30和300 nmol·L^-1的Cy-3-DNA共孵育后,精子的活率分别为82.21%、73.63%、77.38%、76.33%和77.80%;洗涤前精子结合DNA的效率分别为76%、94%、99%、100%,15、30和300 nmol·L^-1组精子结合率均显著高于3 nmol·L^-1组（P＜0.05）。洗涤后精子结合DNA的效率,分别为45%、66%、84%和87%,消化后精子内化DNA的效率分别为44%、56%、71%和76%,并且洗涤后精子结合及消化后精子内化DNA的效率都为300 nmol·L^-1组和30 nmol·L^-1组均显著高于其他两组,而15 nmol·L^-1组显著高于3 nmol·L^-1组（P＜0.05）;Image J对精子结合Cy-3-DNA的强度进行分析的结果表明,外源DNA的量随着外源DNA浓度的增加而显著增加（P＜0.01）。顶体反应后,精子顶体部DNA会有丢失,但精子头部后区的外源DNA依然会保留,因此,顶体反应前后,精子结合外源DNA的精子比率没有降低。15和300 nmol·L^-1 DNA共孵育的精子体外受精后,荧光显微镜下检测显示,合子期胚胎有外源DNA的荧光信号分布,将荧光信号在雄原核附近密集的胚胎记为阳性胚胎,300 nmol·L^-1 DNA共孵育的精子获得合子期胚胎的阳性率为27.89%,显著高于15 nmol·L^-1组的9.00%（P＜0.05）。精子与pEGFP-C1质粒共孵育后,体外受精,结果表明精子与DNA共孵育后,卵母细胞受精率及胚胎卵发育率与对照组相比差异不显著。单囊胚PCR检测15和300 nmol·L^-1的pEGFP-C1质粒与精子共孵育转基因胚胎阳性率分别为8.72%和21.50%;采用RT-PCR方法在300 nmol·L^-1组的囊胚中检测到了EGFP基因 RNA的表达,在荧光显微镜下没有观察到EGFP绿色荧光蛋白的表达。【结论】精子具备结合和内化外源DNA的能力,并能将外源DNA带入卵母细胞,顶体反应会使精子丢失顶体部DNA,但精子头部后区外源DNA依然保留。受精过程外源DNA在基因组中的整合及外源基因表达激活是精子介导转基因效率的关键影响因素。     

猪锚蛋白重复序列和SOCS盒蛋白基因4与生长因子受体结合蛋白基因10的克隆及印迹状态分析

本试验采用单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)直接测序法检测猪锚蛋白重复序列和SOCS盒蛋白基因4(ankyrin repeat and SOCS box containing protein 4,Asb4)与生长因子受体结合蛋白基因10(growth factor receptor-bound protein 10,Grb10)在不同组织器官中的印迹状态。首先,克隆得到了1350 bp的Asb4基因cDNA序列及1811 bp的Grb10基因cDNA序列,然后进行了SNP直接测序法检测。结果发现,Asb4在1月龄仔猪所有检测组织器官中均为双等位基因表达,而Grb10在1月龄仔猪的舌、肾脏、胃、小肠和脑中为父源等位基因表达,在其他组织器官中为双等位基因表达。实时定量PCR结果表明,Grb10在10种组织器官中的表达量存在显著性差异(P<0.05),其中在肺脏组织中的表达量最高,在小肠和脑中表达量最低。上述结果表明,Grb10可能是猪父源表达的印迹基因,而Asb4则属于猪非印迹基因。     

猪不同直径卵泡内卵母细胞胞质成熟及体外发育潜力差异原因的初探

试验根据直径将猪卵泡分为2组:G1组(4~7 mm)和G2组(2~4 mm),对2组卵泡内获取的卵母细胞体外成熟率和发育潜能进行了比较,利用相对定量PCR检测了卵丘细胞中卵丘扩展相关基因Has2、Ptgs2、Ptx31及Pgr的表达水平,应用绝对定量PCR检测了成熟培养前后卵母细胞线粒体拷贝数,并利用5,5'-二巯基-2-硝基苯酸(DTNB)酶循环法检测了体外成熟培养过程中卵母细胞谷胱甘肽(GSH)的含量。结果显示,G1组和G2组卵母细胞体外成熟率分别为95.06%和68.19%,G1和G2组排出第一极体的成熟卵母细胞孤雌激活后的囊胚率分别为51.47%和29.44%,2组卵母细胞在体外成熟率和孤雌发育率上均差异显著(P<0.05)。G1组卵丘细胞在体外成熟培养过程中的扩展程度明显高于G2组,G1组卵母细胞对应的卵丘细胞扩展相关基因Has2、Ptgs2、Ptx31、Pgr的表达水平高于G2组(Has2基因在卵母细胞成熟培养0、24 h除外);G1组卵母细胞线粒体数、谷胱甘肽含量均高于G2组。以上结果表明,大卵泡来源的卵母细胞体外成熟能力和发育潜力优于小卵泡来源的卵母细胞,这可能与卵母细胞成熟过程中卵丘扩展程度、卵丘扩展相关基因表达激活情况、卵胞质内谷胱甘肽含量和线粒体拷贝数有关。