不同方法提取淡色库蚊总RNA的定量比较分析

采用异硫氰酸胍法、Trizol法、Trizol改良法、CTAB法及Trizol+ CTAB 5种方法提取的淡色库蚊总RNA,以期得到最优方法.提取总RNA并用电泳及紫外分光光度计检测,经过Dnase I消化后反转录成cDNA,以此为模板,用CYP6F1引物作定量表达分析.结果表明,与其他几种方法相比,CTAB法提取的效果最好,提取的样品纯度高,完整性好,杂质较少,DNA残留少,降解不明显.CTAB法提取的RNA可以作为eDNA合成和基因克隆的模板,能够满足后续研究的需要.     

淡色库蚊氯菊酯抗性相关基因PR-XP1 cDNA的克隆与序列分析

【目的】克隆淡色库蚊一个全新的氯菊酯抗性相关基因PR-XP1的全长序列,分析、预测其编码蛋白的结构与功能,为阐明该基因的抗性机制及研制新型卫生杀虫剂奠定基础。【方法】依据抗性与敏感品系库蚊差异表达的EST片段（GenBank号:EC093826.1）,设计特异性PCR引物,采用RACE技术,克隆淡色库蚊氯菊酯抗性相关基因PR-XP1的全长cDNA序列,运用生物信息学软件对其同源性与系统进化进行分析,并对PR-XP1编码蛋白的结构与功能进行预测。【结果】获得了全长为2 004bp的淡色库蚊氯菊酯抗性相关基因PR-XP1,该基因具有完整的CDS区,编码249个氨基酸。同源性比对与系统进化分析表明,PR-XP1基因核苷酸序列与致倦库蚊（GenBank号:XM₀01862469.1）、埃及伊蚊（GenBank号:XM₀01658032.1）和冈比亚按蚊（GenBank号:BX021208.1）相关基因的同源性分别为95%,83%和70%;其编码蛋白的氨基酸序列与致倦库蚊、埃及伊蚊、西方蜜蜂、入侵红火蚁、佛罗里达弓背蚁、印度跳蚁等昆虫中"假设性蛋白"的氨基酸序列同源性均达46%以上。结构分析显示,PR-XP1基因编码蛋白可能为具有2个跨膜螺旋的膜蛋白,跨膜区形成了一个特异性的"U"形结构;该基因还具有1个微弱的信号肽位点和24个磷酸化位点。【结论】克隆得到了一个全新的淡色库蚊氯菊酯抗性相关的"保守性假设蛋白"基因PR-XP1,推测其功能与氯菊酯抗性相关。     

蚊耐氯菊酯C6/36细胞构建及耐药相关基因PR-XP1的表达分析

建立蚊耐氯菊酯C6/36细胞,并探讨PR-XP1基因与蚊C6/36细胞对氯菊酯的耐药性之间关系。采用逐步诱导法筛选蚊耐氯菊酯C6/36细胞,观察耐药细胞形态变化、生长状态,测定生长曲线和半数致死剂量;利用荧光实时定量PCR鉴定PR-XP1基因在敏感细胞与耐药细胞中的表达差异。获得耐400μg/m L氯菊酯的C6/36细胞;实时定量PCR检测发现抗药基因PR-XP1在蚊耐氯菊酯C6/36细胞中表达量明显上升。表明构建蚊耐氯菊酯C6/36细胞是研究蚊虫氯菊酯耐药性的有效方法,初步证明PR-XP1基因表达升高可能与蚊虫对氯菊酯的耐药性具有一定的相关性。     

蚊耐氯菊酯C6/36细胞构建及耐药相关基因PR-XP1的表达分析

建立蚊耐氯菊酯C6/36细胞,并探讨PR-XP1基因与蚊C6/36细胞对氯菊酯的耐药性之间关系.采用逐步诱导法筛选蚊耐氯菊酯C6/36细胞,观察耐药细胞形态变化、生长状态,测定生长曲线和半数致死剂量;利用荧光实时定量PCR鉴定PR-XP1基因在敏感细胞与耐药细胞中的表达差异.获得耐400μg/mL氯菊酯的C6/36细胞;实时定量PCR检测发现抗药基因PR-XP1在蚊耐氯菊酯C6/36细胞中表达量明显上升.表明构建蚊耐氯菊酯C6/36细胞是研究蚊虫氯菊酯耐药性的有效方法,初步证明PR-XP1基因表达升高可能与蚊虫对氯菊酯的耐药性具有一定的相关性.     

厌氧棒菌Pif1解旋酶的表达纯化及解旋条件优化

【目的】通过原核表达系统获得嗜热的厌氧棒菌(Anaerobaculum hydrogeniformans)DNA解旋酶Pif1(AnaPif1),研究其体外最佳解旋条件,为深入研究嗜热菌Pif1家族解旋酶工作机理提供参考。【方法】构建重组载体pET15b-sumo-AnaPif1,将重组载体转入表达菌株BL21(DE3)中诱导表达目的蛋白,经Ni-NTA柱和Heparin柱纯化最终获得全长AnaPif1蛋白;利用停流-荧光共振能量转移(FRET)技术,以pH值和Tris-HCl、NaCl、MgCl_2浓度及反应温度、能量供体为考察因素,以反应时间常数或速率常数为指标,摸索该蛋白在体外的最佳解旋条件、最佳能量供体以及底物的偏好性。【结果】成功构建了pET15b-sumo-AnaPif1重组表达载体,通过诱导表达,获得了纯度大于95%的全长AnaPif1蛋白,其大小为55ku,等电点为6.89。AnaPif1在体外的最佳解旋条件为:Tris-HCl(pH7.0)20mmol/L、NaCl 20mmol/L、MgCl_22mmol/L、反应温度37℃;其能够利用4种核苷三磷酸(ATP/GTP/CTP/UTP)作为能量供体,但对ATP有偏好性;该酶还能解旋多种底物(双链DNA、G4-DNA),且对底物选择无明显偏好性。【结论】获得了纯化的AnaPif1解旋酶,明晰了其最佳解旋条件、能量供体及底物的偏好性特征。     

LwaCas13a蛋白的表达纯化与活性分析

【目的】获得高纯度、高浓度、优良反式切割活性的韦德纤毛菌(Leptotrichia wadei)的Cas13a(LwaCas13a)蛋白,为研发基于CRISPR-LwaCas13a系统的动物病毒RNA检测新方法提供重要的生物学工具。【方法】通过PCR、双酶切与连接反应构建pET15b-SUMO-LwaCas13a重组质粒,并进行原核诱导表达与条件优化;发酵100 mL大肠杆菌BL21(DE3)菌诱导表达LwaCas13a蛋白后进行纯化,纯化后利用超滤法浓缩蛋白,使用BCA法检测蛋白浓度。将LwaCas13a蛋白、CRISPR RNA(CrRNA)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)靶标RNA及荧光标记单链RNA(ssRNA)探针共孵育,利用全波长荧光分析仪检测CRISPR-LwaCas13a反式切割活性,与商业化Cas13a蛋白进行活性对比,并优化LwaCas13a与CrRNA最佳结合比例。【结果】成功构建重组质粒pET15b-SUMO-LwaCas13a; LwaCas13a重组蛋白的最佳诱导表达条件为0.4 mmol/L IPTG、18℃诱导16 h;经过纯化最终获得95%纯度、7.5 ...