灰茶尺蠖EgSCP2多克隆抗体制备及组织表达分析

【目的】制备灰茶尺蠖（Ectropis grisescens Warren）固醇转运蛋白（SCP）的多克隆抗体,并检测灰茶尺蠖SCP2蛋白在灰茶尺蠖不同组织中的表达情况,为进一步研究SCP2对胆固醇的转运和利用机制以及其生物学功能奠定基础。【方法】以灰茶尺蠖5龄1 d幼虫中肠cDNA为模板,应用PCR技术扩增得到EgSCP2片段,将EgSCP2目的片段连入pMD18-T载体后进行测序,利用DNAMAN软件分析该基因序列的准确性及编码蛋白的分子质量。以测序正确的EgSCP2基因片段为模板,扩增EgSCP2的开放阅读框,通过BamHⅠ和Hind Ⅲ限制性内切酶连接到原核表达载体pET32a中,并转化大肠杆菌BL21 (DE3)进行原核表达,离心收集并超声波破碎菌体,取上清液和沉淀分别进行SDS-PAGE检测,在不同温度、不同IPTG终浓度条件下优化EgSCP2重组蛋白表达条件。经Ni-NTA树脂层析柱纯化得到EgSCP2重组蛋白。将该蛋白免疫新西兰大白兔,制备兔抗EgSCP2血清抗体,采用间接ELISA方法测定了该血清抗体的效价,并通过Western blotting检测EgSCPx和EgSCP2蛋白在灰茶尺蠖不同组织中的表达情况。【结果】扩增得到EgSCP2基因开放阅读框（ORF）全长为441 bp,编码146个氨基酸,预测编码蛋白的分子质量为16 ku。优化蛋白诱导条件的试验表明,28 ℃、IPTG浓度为1.0 mmol/L时,EgSCP2重组蛋白表达量最高,该条件下通过大肠杆菌表达的EgSCP2重组蛋白分子质量约为34 ku,其大小与预期结果一致,且其在上清液和沉淀中均有表达。间接ELISA法检测结果表明,制备的兔抗EgSCP2抗体具有较好的灵敏度,效价达到1∶256 000。Western blotting检测结果显示,58 ku EgSCPx在5龄2 d灰茶尺蠖的表皮、脂肪体和中肠均有表达,且在中肠的表达量远高于表皮和脂肪体;16 ku EgSCP2仅在表皮和脂肪体中表达。58 ku EgSCPx蛋白在4龄和5龄灰茶尺蠖的幼虫中肠大量表达,在蛹期少量表达,在成虫期几乎不表达。【结论】纯化获得了EgSCP2重组蛋白,其最优表达条件为温度28 ℃、IPTG终浓度1.0 mmol/L;制备了高效价的灰茶尺蠖EgSCP2多克隆抗体,明确了灰茶尺蠖EgSCPx蛋白在不同组织中的表达规律。     

基于提质减害的烟叶醇化技术研究进展

烟叶醇化在提升烟草品质的过程中起着重要的作用.针对提质减害的行业问题,归纳并总结了提升烟叶品质及降低有害物质的烟叶醇化技术,提出了烟叶醇化技术的发展趋势及研究方向.