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旨在构建1羟化酶(CYP27C1)真核表达载体,在293T细胞中重组表达CYP27C1-mycHis,探究cyp27c1基因在成年鸡不同组织中的表达水平,明确1α-羟化酶三级结构特征、与底物识别和活性中心底物结合相关的关键氨基酸。将合成的cyp27c1的开放阅读框(ORF)插入pMD18-T质粒,并将该质粒命名为pMD-cyp27c1。以改造后的质粒为模板,通过PCR扩增cyp27c1 ORF,将其插入pcDNATM3.1,构建真核表达载体pcDNA-cyp27c1。然后分别用pcDNA-cyp27c1及空载体pcDNA瞬时转染293T细胞,48 h后收集细胞,提取线粒体,用Bradford法测定蛋白质的质量浓度。1μg线粒体用于12%聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离,以myc抗体作为一抗检测重组CYP27C1在293T细胞中的表达水平。利用实时荧光定量PCR检测cyp27c1在成年鸡组织中的表达水平。通过生物信息学分析CYP27C1的理化特性,并预测其亚细胞定位,利用同源建模、多序列同源比对和分子对接法研究CYP27C1的空间结构特征以及与底物(25-... 相似文献
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