非洲猪瘟病毒CD2v胞外区蛋白多克隆抗体的制备及其应用

非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)CD2v蛋白是病毒粒子外层囊膜上的糖蛋白,是介导病毒血细胞吸附和鉴定病毒血清型的关键蛋白,对于ASFV疫苗研发和疫病净化具有重要作用。为制备ASFV CD2v胞外区蛋白多克隆抗体,本研究以NCBI公布的China/2018/AnhuiXCGQ毒株的EP402R基因为研究对象,利用生物信息学软件进行分析,确定蛋白胞外区序列并进行同源性比对,将其进行密码子优化后克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建CD2v胞外区蛋白重组表达质粒His-CD2v-ex-pcDNA3.1(+),转染293 F细胞进行表达。SDS-PAGE和Western blot检测结果显示,重组蛋白在293 F细胞中以分泌形式表达,相对分子质量为63～89 kDa,能够与ASFV阳性血清特异性结合。利用Ni-NTA进行亲和层析纯化,将纯化后的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,通过Western blot、免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)和间接免疫荧光试验(IFA)鉴定其生物活性,结果显示兔抗ASFV CD2v胞外区蛋白多克隆抗体能够特异性识...     

鹅星状病毒感染在河南地区的分子流行病学调查

鹅星状病毒(goose astrovirus, GAstV)是引起当前雏鹅痛风疾病的主要病原体,其流行严重影响养鹅产业的健康发展。为研究鹅星状病毒在河南地区的流行情况,本研究于2018年从河南12个地市的养鹅场采集了36份雏鹅痛风样品,采用RT-PCR方法进行检测,并对12个地市代表毒株的ORF1b基因进行了序列测定、同源性分析和系统进化分析。研究结果表明,36份样品均为阳性,阳性率为100%;12个地市代表毒株的ORF1b序列长度均为1 551 bp,各自间的核苷酸同源性为98.7%～99.9%,与河南地区的XX、AstV/HN01/Goose/0103/18、AstV/HB01/Goose/0123/19、AstV/AH01/Goose/0512/18等代表毒株核苷酸同源性为97.9%～99.5%,与国内其他地区的GD、AstV/SDPY/Goose/1116/17、AAstV/Goose/CHN/2017/SD01等代表毒株核苷酸同源性为98.4%～99.7%;系统进化分析显示,12个地市代表毒株与河南及国内其他地区代表毒株,在进化关系上处于同一分支,属于禽星状病毒1群。本研究明...     

干扰素调节因子3基因敲除对伪狂犬病病毒增殖的影响

试验旨在研究敲除干扰素调节因子3 (interferon regulatory factor 3,IRF3)对伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)复制的影响。使用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术建立了IRF3基因敲除PK15细胞系。通过构建重组质粒pIRF3-sgRNA,转染至HEK293T/17细胞,收获慢病毒并感染PK15细胞,经嘌呤霉素筛选获得多克隆细胞系,T7酶切鉴定后通过有限稀释法获得PK15-IRF3~(-/-)单克隆稳定细胞系。为验证敲除IRF3基因稳定细胞系是否构建成功,采用实时荧光定量PCR、Western blotting方法检测PRV相关基因及蛋白的表达,应用荧光显微镜和流式细胞术观察病毒复制情况并进行病毒滴度检测。结果显示,PK15-IRF3~(-/-)细胞系感染PRV-GFP后PK15-IRF3~(-/-)细胞荧光强度明显强于PK15细胞。感染PRV野毒(PRV-QXX)后PK15-IRF3~(-/-)病毒滴度明显强于PK15细胞,PRV的gE蛋白水平明显高于PK15细胞。在mRNA水平检测两种细胞中PRV TK基因的变化也得到相同的结果。进一步研究表明,在感染PRV-QXX后,PK15细胞中IFN-βmRNA会随着时间增加显著增高(P0.05),但PK15-IRF3~(-/-)细胞中IFN-βmRNA则无明显变化。上述结果表明,敲除IRF3基因后显著促进PRV的增殖,IRF3在病毒的复制中发挥着重要作用,为伪狂犬病的防控提供了新的方法和策略。     

新冠肺炎疫情下兽医免疫学教学形式改变的利弊分析

新冠疫情突如其来,给各行各业带来了困局与挑战,教育行业同样经历了考验。全国高校师生为响应"停课不停教,停课不停学"的号召,积极开展网络教学。网络教育在一定程度上确保了教学工作的正常运转,展现出一定的优势,同时也暴露了一些缺点。本文以基于超星学习通兽医免疫学线上教学为例,分析了网络教学的利与弊,为该学科未来的教学模式提供参考。     

干扰素调节因子3基因敲除对伪狂犬病病毒增殖的影响

试验旨在研究敲除干扰素调节因子3 (interferon regulatory factor 3,IRF3)对伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)复制的影响。使用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术建立了IRF3基因敲除PK15细胞系。通过构建重组质粒pIRF3-sgRNA,转染至HEK293T/17细胞,收获慢病毒并感染PK15细胞,经嘌呤霉素筛选获得多克隆细胞系,T7酶切鉴定后通过有限稀释法获得PK15-IRF3^-/-单克隆稳定细胞系。为验证敲除IRF3基因稳定细胞系是否构建成功,采用实时荧光定量PCR、Western blotting方法检测PRV相关基因及蛋白的表达,应用荧光显微镜和流式细胞术观察病毒复制情况并进行病毒滴度检测。结果显示,PK15-IRF3^-/-细胞系感染PRV-GFP后PK15-IRF3^-/-细胞荧光强度明显强于PK15细胞。感染PRV野毒(PRV-QXX)后PK15-IRF3^-/-病毒滴度明显强于PK15细胞,PRV的gE蛋白水平明显高于PK15细胞。在mRNA水平检测两种细胞中PRV TK基因的变化也得到相同的结果。进一步研究表明,在感染PRV-QXX后,PK15细胞中IFN-βmRNA会随着时间增加显著增高(P<0.05),但PK15-IRF3^-/-细胞中IFN-βmRNA则无明显变化。上述结果表明,敲除IRF3基因后显著促进PRV的增殖,IRF3在病毒的复制中发挥着重要作用,为伪狂犬病的防控提供了新的方法和策略。     

PK-15细胞敲除TANK结合激酶1基因促进猪伪狂犬病病毒复制的研究

TANK结合激酶1(TBK1)是病毒感染时IRF3、IRF7磷酸化及Ⅰ型干扰素表达的关键酶,在抗病毒天然免疫应答和获得性免疫应答中发挥重要作用。为研究TBK1基因敲除对猪伪狂犬病病毒(PRV)复制的影响,首先利用CRISPR/Cas9技术构建猪TBK1基因稳定敲除PK-15细胞系,并利用CCK-8检测敲除TBK1对PK-15细胞活力的影响。然后利用流式细胞术检测PRV-GFP荧光强度,用RT-qPCR检测PRV-gB、PRV-gE、PRV-TK、IL-1β、IFN-β和ISG15的转录水平,用Westernblot检测PRV-gB和PRV-gE蛋白表达水平,以及通过滴度测定检测子代病毒的感染力,综合评价TBK1基因稳定敲除PK-15细胞对PRV病毒复制的影响。结果显示:T7E1检测结果显示TBK1基因外显子2区的3个sgRNA靶位点均切出了目的条带,选取编辑效率最高的TBK1-sgRNA1细胞系进行单克隆化培养,获取6株稳定敲除TBK1基因的单克隆细胞,随机选取4号细胞株进行CCK-8检测,结果显示敲除TBK1对PK-15细胞活力无影响。流式检测结果显示PRV-GFP感染阳性细胞占总PK-15细胞的56.89%,PRV-GFP感染阳性细胞占总PK-15-TBK1-/-细胞的77.95%,表明PK-15-TBK1-/-细胞可以促进PRV-GFP复制。RT-qPCR及WB检测显示该细胞系可以促进PRVmRNA转录和蛋白表达。滴度测定结果显示,PRV-QXX在PK-15细胞复制后TCID50为10^6.8TCID50·0.1mL^-1,而在PK-15-TBK1-/-细胞中复制后TCID50为10^8.5TCID50·0.1mL^-1。另外,RT-qPCR结果显示该细胞系可以抑制PRV感染引起的IL-1β、IFN-β和ISG15转录上调。以上结果表明TBK1基因敲除PK-15细胞系促进PRV复制,可能与IL-1β、IFN-β和ISG15转录水平抑制有关。     

凋亡相关斑点样蛋白敲除PK-15细胞系的建立及对PRV感染的影响

本试验旨在研究凋亡相关斑点样蛋白(ASC)的基因敲除对猪伪狂犬病病毒(PRV)感染PK-15细胞的影响.以慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术,构建猪肾上皮细胞(PK-15)A SC基因稳定敲除细胞系,通过T7核酸酶检测靶基因的敲除效率;CCK-8试剂盒检测PK-15敲除ASC基因对细胞增殖的影响;采用流式细...     

非洲猪瘟病毒K205R蛋白特异性纳米抗体的筛选与鉴定

【目的】利用噬菌体展示技术筛选非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)K205R蛋白的特异性纳米抗体。【方法】将原核表达、纯化的ASFV K205R蛋白免疫双峰驼，采集全血，分离外周血淋巴细胞，提取总RNA并反转录，巢式PCR扩增VHH基因，构建VHH噬菌体文库，利用噬菌体展示技术筛选K205R特异性纳米抗体。【结果】成功构建库容量为5×10⁸的VHH噬菌体文库，然后利用噬菌体展示技术经过3轮淘选，特异性VHH噬菌体得到明显富集，氨基酸序列比对显示共筛选出5株K205R蛋白的特异性纳米抗体，分别为ASFV-K205R-Nb1、ASFV-K205R-Nb14、ASFV-K205R-Nb35、ASFV-K205R-Nb64和ASFV-K205R-Nb82。【结论】筛选的5株纳米抗体均具有良好的特异性，其中ASFV-K205R-Nb1、ASFV-K205R-Nb35和ASFV-K205R-Nb82具有更好的亲和力，为以纳米抗体作为灵敏探针建立的特异性强、灵敏度高、成本低的新型ASFV血清学诊断方法提供依据。     

非洲猪瘟病毒p72蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备

为了研发非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)的免疫学诊断试剂，试验将ASFV B646L基因克隆至pET-30a(+)载体中构建表达载体pET-30a(+)-p72,利用大肠杆菌表达系统表达重组蛋白，采用SDS-PAGE分析诱导表达的大肠杆菌，以镍柱对重组蛋白进行纯化，通过SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定纯化的重组蛋白。用纯化后的重组蛋白免疫Balb/c小鼠，通过细胞融合方法制备杂交瘤细胞。采用间接ELISA方法筛选并检测单克隆抗体，以Western-blot及IFA方法鉴定单克隆抗体的特异性，并通过Mouse Monoclonal Antibody Isotyping ELISA Kit鉴定单克隆抗体的亚型。结果表明：PCR扩增得到大小约为1 941 bp的B646L基因，并成功构建了表达载体pET-30a(+)-p72。诱导表达的大肠杆菌在72 ku处出现目的条带，纯化后的重组蛋白p72在72 ku处出现目的条带。筛选出4种单克隆抗体2C7D8、2E6D12、3B10E3、4G5E6,其效价在1∶100 000～1∶500...