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为快速定量大麦贮藏蛋白基因B-hordein差异表达,利用SYBR Green I 染料法测定转基因大麦和对照花后10 d籽粒B-hordein表达量,通过RT-PCR扩增B-hordein和内参基因actin片段,对PCR退火温度、引物浓度等进行优化,结合扩增曲线和熔解曲线分析。结果表明,转基因大麦B-hordein基因表达量较对照品种Golden Promise显著降低(P < 0.05),B-hordein和actin扩增片段分别在(84.51±0.01) ℃和(80±0.01) ℃处显示特异性单峰,可成功建立转基因大麦B-hordein SYBR Green I实时定量PCR法。 相似文献
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为限制大麦籽粒中贮藏蛋白的积累,降低其蛋白质含量,以大麦幼胚为受体材料,采用农杆菌介导的转化方法,将大麦B组醇溶蛋白基因gp4/antisense gp4片段与Ubi启动子相连导入大麦,经PCR检测证实,含有gp4反向重复基因片段的RNAi抑制表达框架已成功转入大麦。RT-PCR结果表明,转基因株系中B-Hordein mRNA积累受到明显抑制。收获T1代籽粒,经近红外谷物分析仪测定表明,2个转基因大麦株系籽粒蛋白质含量(分别为11.4%、11.7%)较对照(12.3%)降低。因此,利用RNA干涉技术降低大麦蛋白质含量是可行的。 相似文献
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日前,山东省政协部分常委和委员在李殿魁副主席带领下;到泰安市和莱芜市就我省林业建设情况进行了视察,亲身感受到了我省林业发展的可喜变化。 农田林网保丰收 当视察团来到肥城市孙伯镇时,天正下着蒙蒙细雨。公路两边呈“田”字状排列的速生白杨在雨雾中愈发显得青翠挺拔、枝繁叶茂。该镇负责同志介绍说,80年代以前,这里还是风沙大、土地 相似文献
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半夏凝集素基因的克隆及转基因烟草对蚜虫的抑制作用 总被引:1,自引:0,他引:1
采用同源序列克隆方法,通过设计特异性引物从甘肃西和半夏叶片基因组DNA中克隆到1条1 069 bp的半夏凝集素基因pta,与以同科内植物的mRNA为模板扩增得到的凝集素基因序列的同源性很高,达到98%以上,功能区完整,具有1条信号肽和3个甘露糖结合区,GenBank登录号AY725425。用该基因替换pBI121载体的GUS基因,正向插入35S启动子之下,构建了植物表达载体pBI-pta。通过农杆菌介导法转化烟草,从20株Kan抗性植株中得到PCR检测阳性植株14株,证明pta已整合到烟草基因组中。对随机挑取的7株PCR阳性植株进行了抗蚜虫(Myzus persicae)筛选试验,结果表明:不同株系蚜口密度抑制率在22.5%~89.4%,平均蚜口密度抑制率56.2%。 相似文献
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根癌农杆菌介导的大麦幼胚遗传转化影响因素研究 总被引:1,自引:0,他引:1
为建立和优化根癌农杆菌介导的大麦遗传转化体系,以大麦幼胚为转化受体,研究了根癌农杆菌介导法转化大麦的主要影响因素。结果表明,以gus基因瞬时表达率、抗性愈伤组织诱导率为转化指标,筛选出了对大麦幼胚感染力比较强的农杆菌菌株EHA105,以及高敏感受体基因型甘啤4号和秀81-47等。实验结果还表明,预培养1 d的大麦幼胚具有较高的瞬时表达率(91%),是较好的转化受体。菌液侵染浓度OD600=0.5,侵染时间为30 min时转化效率最高。在此基础上,侵染后幼胚与农杆菌采用液体共培养方式可明显提高转化效率,gus基因瞬时表达率最高可达90%。在优化条件下,转化约30 d后抗选择剂潮霉素(Hyg)的愈伤组织占受体组织总数的34.2%。 相似文献
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利用RNAi抑制B-hordein合成降低大麦籽粒蛋白质含量 总被引:3,自引:1,他引:2
【目的】通过RNAi策略抑制大麦籽粒B-hordein的表达,获得高氮肥水平下籽粒蛋白质含量降低的转基因大麦新种质,探索大麦品质改良新途径。【方法】采用同源PCR技术克隆大麦B-hordein核心保守序列,通过Gateway技术构建大麦B-hordein的RNAi植物表达载体pBract207-zz-gp4,利用农杆菌介导法转化大麦Golden Promise幼胚,获得转基因植株。通过PCR检测、Southern杂交验证RNAi构件在转基因大麦及其后代基因组的整合情况。采用半定量RT-PCR分析转基因大麦花后不同发育时期B-hordein转录表达情况。基于近红外谷物分析仪测定蛋白质含量,并进行醇溶蛋白SDS-PAGE检测,以筛选蛋白质含量降低的转基因大麦株系。开展氮肥运筹相关试验,检验RNAi效率及高氮肥水平下转基因大麦蛋白质含量变化情况。【结果】获得大麦B-hordein片段2条(Gp4和Gp5),测序结果表明该片段大小为349 bp,聚类分析表明该序列跟已知大麦醇溶蛋白基因同源性最高达92%,与该基因已登录的mRNA序列同源性高于98%,确认所得片段为大麦B醇溶蛋白基因片段。利用Gateway技术将Gp4片段正反向插入载体pBract207,反向重复序列用i18 和 iv2 intron连接,构建了Ubi启动子驱动的大麦B-hordein RNAi植物表达载体 pBract207-zz-gp4。通过农杆菌介导转化大麦Golden Promise幼胚,结合目标基因及筛选标记基因的PCR验证,获得含有RNAi构件及筛选标记基因的转基因大麦株系11个。Southern杂交检测表明RNAi构件已经稳定整合到T2/T3转基因大麦基因组。随机选取6个T3转基因大麦株系,半定量RT-PCR结果表明花后不同发育时期转基因大麦籽粒B-hordein表达水平明显低于非转基因对照,20 d时转基因株系表达量不仅相比同期对照降低28.19%-55.19%,而且在各时期中也最低。利用随机选取的T1和T3籽粒进行蛋白质含量测定表明,8个转基因大麦株系的蛋白质含量相比非转基因对照显著降低,SDS-PAGE电泳结果显示与非转基因相比,转基因各株系B-醇溶蛋白比率有不同程度降低,其中3个株系B-醇溶蛋白比率降低明显,平均减幅为49.42%。采用蛋白质含量降低的转基因大麦株系RNAi-20开展氮肥运筹试验,结果表明,高氮肥水平HN2及HN3处理,该株系蛋白质含量显著低于非转基因对照;施以等量高氮肥时,伴随氮肥后移(HN2到HN3),该株系总蛋白含量相对非转基因对照逐渐降低。SDS-PAGE电泳结果显示B醇溶蛋白含量降低,电泳带型发生变化。【结论】RNAi技术能抑制籽粒B-hordein表达,降低B-醇溶蛋白含量,高氮肥水平下能显著降低大麦蛋白质含量。 相似文献