水稻白叶枯病菌毒性表达的负调控因子PXO_02944的分子鉴定

【目的】水稻黄单胞水稻致病变种（Xanthomonas oryzae pv. oryzae, 简称Xoo）侵染引起水稻白叶枯病,在侵染过程中Xoo可产生胞外多糖(EPS)、胞外酶、黏附因子、T3SS以及其产生的效应因子等毒性因子。细菌第二信使环鸟苷二磷酸（c-di-GMP）的水平在Xoo毒性调控中发挥了重要的作用,而PXO_02944是包含REC、GGDEF和EAL结构域的蛋白,是c-di-GMP信号蛋白家族的成员,研究旨在阐明水稻白叶枯病菌的环鸟苷二磷酸信号蛋白家族成员PXO_02944的基因结构和功能。【方法】根据PXO_02944基因序列信息,以PXO99A基因组DNA为模板,设计引物扩增PXO_02944基因全长,将其GGDEF结构域和EAL结构域分别与已经报道的保守的GGDEF结构域或EAL结构域蛋白进行氨基酸序列比对分析;分别扩增PXO_02944左右臂片段,将其与目的载体pK18mobsacB载体连接,得到质粒pK2944,将pK2944与pMD-GmR载体回收获得的GmR基因片段进行连接,获得重组质粒pK2944-GmR,用于构建基因突变体。将PXO_02944全长基因克隆到载体pHM1上,获得重组质粒pHM1-2944并转化到ΔPXO_02944中,即获得互补菌株ΔPXO_02944::C。对野生型菌株、突变体和互补菌株进行表型测定,分析PXO_02944 基因缺失突变对Xoo致病性和EPS产生、生物膜形成、胞外酶活性和鞭毛运动性的影响,并通过qRT-PCR方法测定EPS合成基因和毒性相关基因的表达。【结果】用特异性引物进行PCR扩增,成功地从野生型菌株PXO99A中克隆了PXO_02944;生物信息学分析发现,PXO_02944蛋白具有磷酸化信号接收的REC输入结构域和GGDEF、EAL输出结构域,但GGDEF和EAL结构域保守序列发生了突变。与野生型菌株PXO99A相比,虽然PXO_02944突变体胞外纤维素酶和木聚糖酶活性、鞭毛运动性都无明显变化, 但其对水稻的致病性、EPS产生和生物膜形成能力显著增强,T3SS调控基因hrpG和EPS合成基因gumG的转录水平也明显升高。【结论】应答调控因子PXO_02944负调控了水稻白叶枯病菌致病性、EPS产生和生物膜形成这些毒性因子的表达。