猪脑心肌炎病毒RT-PCR检测方法的建立

为了对猪脑心肌炎病毒(EMCV)进行血清学调查和临床检测,试验根据猪脑心肌炎病毒5'端结构蛋白VP2基因序列设计、合成1对特异性引物,建立检测猪脑心肌炎病毒385 bp片段的RT-PCR检测方法。结果表明:该方法对脑心肌炎标准毒株VR-129B(GenBank登录号为X74312)的检测结果为阳性,对标准毒株的细胞培养物检测的敏感度达0.1TCID50;而对猪乙型脑炎病毒、戊型肝炎病毒、猪轮状病毒、猪瘟病毒、口蹄疫病毒的检测结果为阴性。说明该方法特异性强、灵敏性高,可以用于猪脑心肌炎病毒的检测和早期诊断。     

β-丙内酯对脑心肌炎病毒灭活效果的试验

通过研究β-丙内酯(BPL)对脑心肌炎病毒(EMCV)灭活效果以及优化灭活条件,为制备脑心肌炎诊断试剂和疫苗提供参考依据.用终浓度分别为1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000等的β-丙内酯灭活103 TCID50滴度猪脑心肌炎病毒,采用4℃灭活4 h、8h、12h后37℃C 2h,并将灭活后的病毒接种敏感细胞VREO上观察细胞病变(CPE)情况,选择未出现CPE的细胞孔盲传3代后,采用ELISA和PCR的方法观察灭活效果.结果显示:BPL浓度和反应时间与灭活效果存在明显的线性关系,但BPL浓度越高抗原性下降幅度越大,RT-PCR未有扩增,说明BPL可以用于EMCV的灭活,且根据试验结果优选灭活条件为BPL浓度为1∶2 000,4℃灭活8h为最佳.结论表明:BPL完全可以用来灭活EMCV,为今后开发灭活疫苗或诊断试剂的生物安全性提供了保证.     

跨膜蛋白39A基因SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立及评价

为建立一种快速检测跨膜蛋白39A(TMEM39A)基因的方法,根据GenBank中登录的不同种属TMEM39A基因序列的保守区域,设计并合成1对荧光定量通用性引物,经过条件优化,建立了检测TMEM39A基因的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法。结果显示:标准品模板在3.937×10⁸~3.937×10³拷贝·μL^-1范围内呈良好的线性关系,R²可达0.999;该方法特异性较好,检测灵敏度可达3.937×10² 拷贝·μL^-1;组内和组间变异系数均小于1%,具有较高的重复性和稳定性;利用该方法能够检测出不同细胞中的TMEM39A含量,具有种属通用性。该研究方法的建立为临床上提供了一种TMEM39A的快速检测和定量分析技术。