平菇和香菇降解秸秆的培养研究

以P-1（平菇）和L-1（香菇）为供试菌株,经正交试验分析确定培养的最佳酶活条件为：26℃,含水量55%,菌量（P-1/L-1）3∶1,含氮量2.0%。经测定,共同培养时粗蛋白含量提高34.55%,粗脂肪含量提高3.24%,粗纤维含量降低17.30%。将2株菌分别培养进行比较发现,菌没有颉颃,2株菌共同培养制备秸秆饲料最佳。     

黑曲霉Uγ-2(Aspergillus niger Uγ-2)产菊粉酶的研究

研究了黑曲霉Uγ－2的产酶进程及其产酶条件，结果表明：在1g/mL^-1菊芋汁中添加30mg/mL^-1的牛肉膏，调节初始pH6.0，摇瓶转速为180r/min^-1,30度条件下发酵最高酶活力为180．33umol/min^-1,mL^-1。发酵初期产酶速率较快，pH下降速度快，在发酵进行到72－96h期间，出现产酶的迟缓期，此时发酵液的pH为4．62－4．38，以后菊粉酶活力明显上升，在192h时菊粉酶活力达到最高值，发酵液pH降到最低点，在发酵进程中，发酵液可溶性蛋白出现2个高峰，72h出现第一高峰，与菊粉酶活力比较表明此时主要是杂蛋白产生所致；在192h时出现的第二高峰与菊粉酶活力同步，说明主要是菊粉酶产生，与生物量的变化曲线比较，尽管在发酵初期产酶速率较快，但菊粉酶在发酵液中大量积累出现在120h后（对数增长期的后期）。γγγγγ     

鸭梨多酚氧化酶基因CDS区的克隆及表达

以鸭梨(Pyrus bretschneideri Rehd.)果皮基因组DNA为模板,根据已经发表的多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)基因保守序列设计引物,利用PCR技术,克隆得到鸭梨多酚氧化酶编码区序列,将此核酸序列克隆到载体pGEM-T,酶切鉴定后测序,结果表明该段序列含有1782个核苷酸,编码593个氨基酸。对鸭梨多酚氧化酶基因片段的一致性分析和进化树分析表明,该片段与沙梨(Pyrus pyrifolia,AB056680)、苹果(Malus domestica,L29450)、李(Prunuss alicina,AY866432)以及杏(Prunus armeniaca,AF020786)的一致性分别为99%、96.3%、82%和51.4%,绘制的进化树和形态学分类地位相一致。将该片段连接到表达载体pET39b上,获得的重组子命名为pET39b-PPO,热激法转化表达受体大肠杆菌BL21(DE3)菌株,用IPTG进行诱导。SDS-PAGE分析表明,PPO基因在大肠杆菌中被诱导表达蛋白质相对分子质量约66ku,检测表明具有多酚氧化酶的活性。     

鸭梨果胶甲酯酶基因反义表达载体的构建及转化

果胶酯酶(pectin methylesterase,PME)催化细胞壁中多聚半乳糖醛酸的脱甲酯化,可以降解植物细胞壁中的果胶多糖而与果实软化有关。本研究根据白梨果胶酯酶基因PcPME4的序列,设计一对含有特定酶切位点的特异性引物,以鸭梨(Pyrus bretschneideri Rehd.)cDNA为模板通过PCR扩增得到一段294bp的PME基因片段。将片段反向插入植物表达载体pBI121的CaMV35S启动子和NOS终止子之间,经限制性酶切分析和测序分析证明成功构建PME基因的反义表达载体pBI121-AsPME。将pBI121-AsPME电转化农杆菌EHA105,利用含pBI121-AsPME的农杆菌工程菌液侵染鸭梨外植体后于抗性培养基中诱导愈伤组织,获得的抗性愈伤组织经PCR初步检测含有反向PME基因片段,荧光定量PCR检测结果显示受侵染的愈伤组织中PME基因表达量降低,表明反向插入的PME基因片段起到了抑制内源基因表达的效果。     

白腐真菌菌株共培养降解玉米秸秆的研究

[目的]探究白腐真菌菌株共培养对降解玉米秸秆的影响。[方法]以白腐真菌(P-6和L-9)为供试菌株,采用分光光度法、DNS法、凯氏定氮法、索氏提取法等,分别测定两菌共同降解玉米秸秆时纤维素酶和木质素酶的酶活力、全纤维素的降解率、粗蛋白和粗脂肪的增加率,并与两菌分别培养进行综合比较。[结果]两菌共培养的最佳条件为pH值5.5、含水量60%、菌量(L-9/P-6)1∶3、含氮量2.5%;共培养后粗蛋白含量和粗纤维含量分别提高了35.6%和3.6%,粗纤维含量降低了21.3%。[结论]从总体思路考虑,两菌共培养优于单独培养。该试验同时获得了1种高蛋白、多营养的饲料载体,为研究玉米秸秆饲料奠定了基础。     

4种梨的多酚氧化酶基因克隆及其序列比较

以4种不同来源的梨基因组DNA为模板,根据已经发表的多酚氧化酶基因序列设计引物,利用PCR技术,克隆到了鸭梨、雪花梨、砂梨、黄冠梨约1．8kb的完整多酚氧化酶基因,将纯化后的扩增产物克隆到质粒pGEM-T veetor中,转化DH-5α菌,挑选阳性克隆进行测序。利用Clustalx软件对PPO核苷酸序列进行了同源性分析,用DNAStar软件对PPO核苷酸序列进行进化树分析,并进行部分植物PPO氨基酸的同源性分析。结果表明,4种梨多酚氧化酶基因的蛋白编码区含有1782个核苷酸,鸭梨基因已经在GenBank上登录,登录号为EU048225。梨多酚氧化酶基因与其他植物中的多酚氧化酶基因有较高的相似性,尤其在铜离子结合部位,所有的植物基本上一致;5种梨的同源性高达98％。基于植物PPO基因核苷酸序列的分子进化树显示,可分为两大类,梨的多酚氧化酶可以与大多数的木本植物聚合成一个组。