CHD9:一个新的与流感病毒PA蛋白相互作用的宿主因子

PA蛋白是禽流感病毒(AⅣ)聚合酶的组成部分,对AIV的复制具有重要作用.为鉴定家鸭体内与AIV PA蛋白相互作用的宿主蛋白,本研究利用酵母双杂交系统,以表达A/goose/Hubei/65/05(H5N1)AIV PA蛋白的重组质粒为诱饵,筛选家鸭脑组织cDNA文库,鉴定得到一个cDNA片段,经测序分析表明,该cDNA片段编码蛋白为色素域解旋酶DNA结合蛋白9(CHD9).将重组诱饵质粒pDEST32-PA与捕获的鸭cDNA重组质粒共转化MaV203受体菌,进行X-gal显色反应检测,分析结果显示,菌落可以迅速变蓝,并且菌落在SC-Leu-TrpHis+3AT 3种营养缺陷培养基平板上生长良好.证明CHD9与PA蛋白在酵母双杂交系统中具有较强的相互作用.CHD9的初步鉴定为研究AIV在机体中的复制过程奠定了基础.     

蛋白激酶R的原核表达、纯化及多克隆抗体制备

【目的】构建蛋白激酶R的原核表达系统并制备其多克隆抗体.【方法】利用RT-PCR方法从人的A549细胞中扩增蛋白激酶R(PKR)基因,将其克隆到表达载体pGEX-6P-1中,经纯化后制备特展异性多克隆抗体.【结果】PKR基因经测序鉴定后转化宿主菌BL21(DE3)感受态细胞,经终浓度0.5mmol/L IPTG诱导表达GST-PKR融合蛋白,SDS-PAGE分析表明融合蛋白获得稳定表达.表达产物经Glutathione-sepharose 4B亲和层析初步纯化后,用凝血酶切除GST标签,而后经离子交换层析及分子筛在AKTA Explorer上进一步纯化,得到高纯度无标签的PKR蛋白.以纯化后的PKR蛋白为抗原免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,斑点杂交试验检测其效价达到1∶50 000以上,Western-blot和间接免疫荧光试验(IFA)表明制备的多抗与PKR蛋白的反应具有高度特异性.【结论】PKR蛋白在大肠杆菌中成功表达,且制备的多克隆抗体可用于PKR蛋白的检测,从而为研究PKR在病毒感染过程中的作用提供了重要的工具.     

人源肺细胞cDNA文库构建及与流感病毒NP互作宿主蛋白的筛选

【目的】构建肺组织细胞Calu-3及A549的高质量酵母cDNA文库并筛选与流感病毒NP蛋白相互作用的宿主因子,为深入研究流感病毒NP蛋白功能、病毒复制及致病机制奠定基础。【方法】提取等量Calu-3及A549细胞的总RNA,混合后反转录生成cDNA,利用长距离PCR(LD-PCR)扩增合成dscDNA,用CHROMA SPINTM+TE-400纯化柱纯化dsDNA,按照Clontech公司的Make Your Own"MatePlate"Library System操作程序,将带有同源臂的dscDNA与线性化p GADT7-Rec共同转化Y187酵母感受态细胞,涂布SD/-Leu平板后于30℃培养4d左右,收集所有菌落,混匀分装即为Calu-3和A549细胞cDNA的酵母文库,并对文库库容、滴度及多样性进行分析。利用Eco RⅠ和Bam HⅠ双酶切将A/Auhui/2/2005(H5N1)NP定向插入pGBKT7载体,构建高致病性流感病毒NP的诱饵质粒p GBKT7-NP,经验证该质粒无自激活活性,并进一步采用构建完成的Calu-3/A549细胞酵母文库进行杂交筛选,筛选得到的正确阅读的猎物质粒与诱饵质粒共转Y2H Gold酵母菌,分别以BD-P53/AD-T7作为阳性对照和BD-Lam/AD-T7作为阴性对照,挑取最终在SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-gal/Aro A(SD/-4/X/A)固体培养板上生长良好且变蓝的菌落,即为候选与目标蛋白互作阳性的蛋白,提取酵母质粒,进行测序分析、序列比对和Gene Ontology分析。【结果】提取两种细胞RNA 28S与18S条带清晰,5S条带暗淡,表明所提RNA质量较高,基本无降解;对提取的RNA反转录纯化获得dscDNA,dscDNA条带呈弥散状,片段大小分布于500—2 000bp之间,说明不同丰度及大小的RNA均成功反转录;构建的dscDNA文库库容为1.5×10~7,滴度为2.2×10~8cfu/m L,重组率为88%,PCR鉴定文库插入片段,条带大小不一、多样性好;利用诱饵质粒与文库进行双杂交筛选,回交验证后得到11个与NP蛋白互作的宿主因子。经Gene Ontology分析显示,11个宿主因子参与的生物过程包括:细胞凋亡、胚胎发育、可变剪接、转录调节及细胞增殖等;涉及的分子功能包括:GTP结合活性、金属离子结合活性、DNA结合活性及转录因子活性。【结论】成功构建同时含有Calu-3和A549两种人源肺细胞cDNA的酵母文库,文库覆盖cDNA更全面,为后期筛选与流感病毒其它蛋白互作的宿主蛋白奠定基础,筛选得到与NP蛋白存在相互作用的宿主因子为进一步深入研究NP功能提供了可靠的前期数据。     

禽流感病毒B类等位基因NS1蛋白的原核表达、纯化及热稳定性分析

A型流感病毒的非结构蛋白基因(non-structural protein,NS)在进化上可以分为等位基因A和B,两者之间同源性低于70％;NS1是流感病毒对抗宿主免疫系统的主要毒力因子之一.本研究在序列比对分析的基础上,表达、纯化了本实验室保存的4株B类等位基因禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV) (A/duck/Hunan/S1256/12(H3N8),A/environment/Hunan/S4484/11(H12N7),A/duck/Guangdong/07/00(H5N1)和A/duck/Shanghai/08/01 (H5N1))的NS1蛋白,并对其进行稳定性分析.首先从感染的鸡胚尿囊液中提取病毒总RNA,利用特异引物Uni12反转录获得cDNA,以其为模板PCR扩增得到NS1全长片段,利用BamH Ⅰ和NotⅠ双酶切将其定向插入pGEX6P-1载体,大肠杆菌(Escherichia coli)BL21菌株中诱导表达.该蛋白在纯化过程中稳定性差,沉淀析出.为此,进一步构建NS1蛋白截短突变体(1M-202A,R38A/K41A),并在BL21菌株中诱导表达,经过GE health Glutathione sepharose 4B亲和层析、Source Q阳离子交换柱层析和Hitrap Superdex75分子筛凝胶层析逐步纯化,然后进行SDS-PAGE凝胶纯度分析,并测定OD320,进行蛋白热稳定性分析.结果表明,经进化分析,4株病毒均属于禽流感病毒B类等位基因群,4株病毒NS1蛋白经过全长野生型、全长突变体及截短突变体的逐步优化表达,截短突变体NS1蛋白表达质量相对较高,最终经过逐步纯化获得纯度达到90％以上的蛋白样品,且4株病毒中A/duck/Hunan/S 1256/12(H3N8)NS1蛋白的稳定性最好.研究结果为进一步研究其分子结构与功能提供了基础资料.