顶头孢霉原生质体制备、再生及带vgb基因的质粒DNA转化条件的研究

对头孢菌素C的工业生产菌种顶头孢霉(Cephalosporium acremonium)原生质体形成和再生条件进行了研究。优化后的制备及再生条件为:在蛋白胨固体培养基上培养110~120 h的菌丝体,30℃条件下经1%蜗牛酶和1%纤维素酶混合液酶解3.5 h,原生质体得率最高可达2.377×107个/mL;在以KC(0.6 mol/L KCl+25mmol/L CaCl2.2H2O)为渗透压稳定剂的再生培养基上进行培养,再生率可达40%。用pMK4-LV质粒通过电击法对原生质体进行转化,成功得到了重组子,转化率约为10个转化子/μg质粒DNA。转化子的PCR鉴定结果表明,外源基因已转入顶头孢霉基因组。     

产芽孢木质素降解菌MN-8的筛选及其对木质素的降解

【目的】分离、筛选产芽孢的高效木质素降解细菌,并进一步研究其对木质素的降解作用,为木质素微生物降解规模化应用提供理论依据。【方法】采用苯胺蓝（Azure-B）变色圈法,结合木质素降解酶活力测定从牛粪中分离筛选出产芽孢的木质素降解菌。通过形态特征观察、生理生化试验、16S rDNA以及gyrB序列分析对其中活性最强的菌株进行种属鉴定。利用菌株进行玉米秸秆堆积发酵,监测发酵过程中木质素过氧化物酶（LiP）酶活力、锰过氧化酶（MnP）酶活力以及玉米秸秆中木质素含量的变化,考察菌株对玉米秸秆木质素的降解作用。利用气相色谱-质谱联用（GC/MS）方法对菌株发酵后玉米秸秆中的木质素降解产物进行分析,推测菌株对木质素的降解机制。【结果】分离筛选到一株活性较高的产芽孢的木质素降解细菌MN-8,经形态特征观察、生理生化试验以及16S rDNA序列分析,鉴定菌株MN-8属于芽孢杆菌属（Bacillus）。利用16S rDNA序列分析发现MN-8菌株与地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）和解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens）同源性均高于99%。而基于gyrB序列构建的系统发育树显示,该菌株与解淀粉芽孢杆菌同源性最高,为99%。因此确定MN-8菌株为解淀粉芽孢杆菌。在玉米秸秆堆积发酵16 d后木质素降解率可达24%;发酵的6-8 d及10-12 d 两个阶段内,分别出现MnP酶活力及LiP的产酶高峰期,相对应两个阶段内秸秆木质素的降解最为显著;GC/MS分析显示菌株MN-8可将玉米秸秆中木质素降解成4-羟基-3,5二甲氧基苯乙酮等芳香族类化合物及短链脂肪酸类等小分子物质。【结论】高效木质素降解菌解淀粉芽孢杆菌MN-8可以通过断裂木质素单体之间的连接键β-O-4,高效降解秸秆木质素成为小分子芳香族化合物等物质,且其对秸秆木质素的降解依赖于LiP及MnP的产生。     

高活性木质素降解菌株T-8的分离、筛选与鉴定

为了筛选对木质素有降解能力的菌株,本试验从菜地土壤、动物粪便、青贮饲料中分离筛选出79株产芽孢细菌,初筛获得具有木质素降解能力的菌株20株,经过复筛,筛选出一株具有较高木质素降解能力的菌株T-8,其木质素过氧化物酶酶活为626.67 U/L。对T-8进行形态鉴定、生理生化特征鉴定和16S rDNA序列分析,鉴定该菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens),其与B. amyloliquefaciens的相似性高达99.91%。     

棉花黄萎病拮抗细菌HMB-1005鉴定及定殖

以大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)为指示菌,对从棉田土壤中已经分离筛选到的细菌HMB-1005进行形态、19项生理生化特征及16S rDNA试验,结果表明,HMB-1005为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens);通过灭菌土和非灭菌土进行盆栽试验,拮抗菌HMB-1005芽孢液浸种、土壤全部混菌和部分混菌3种处理,经过5个月的盆栽试验表明,拮抗细菌HMB-1005能够在灭菌土和非灭菌土中定殖,且定殖数量达106cfu/g土左右,并仍能保持较高的抑菌活性。通过对棉苗根内细菌的分离,证实拮抗细菌HMB-1005能在棉花根内定殖,数量达到103cfu/g。实验结果显示,灭菌土的拮抗菌数高于非灭菌土,并且3种处理方式差异不明显,在实际生产应用中,建议使用浸种方法。     

草莓根腐病生防芽孢杆菌的筛选鉴定与盆栽防效试验

为了获得草莓根腐病病原菌尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的拮抗芽孢杆菌,对本实验室筛选保存的各类植物病原菌的拮抗芽孢杆菌进行初筛和复筛;对复筛获得的菌株进行形态特征、生理生化试验和16SrDNA序列分析,以确定其种属;采用盆栽试验检测了其生防效果。通过试验获得了一株对尖孢镰刀菌具有较好拮抗活性的芽孢杆菌菌株HD-5,并鉴定其为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens),盆栽防治效果达到77.78%,具有较好的草莓根腐病防治潜力。     

棉花黄萎菌拮抗菌BDT-25的鉴定及抗菌蛋白产生条件研究

拮抗细菌BDT_25是从根际土壤中分离到的一株对棉花黄萎病菌具有强烈抑制作用的芽孢杆菌。经生理生化特征的鉴定,证明BDT_25菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。此外,该菌株还对棉花枯萎病菌、棉花立枯病菌等10种其他病原真菌的生长具有显著的抑制作用,为一株广谱拮抗细菌菌株。通过对BDT_25菌株培养条件的研究发现,采用NB液体培养基,28℃,170 r/min培养48 h所得发酵液对棉花黄萎病菌的抑制作用最强。其发酵液经硫酸铵沉淀粗提到对棉花黄萎病菌具有抑制作用的提取物,进一步实验表明,该拮抗物质对热和多种蛋白酶敏感,证实其为抗菌蛋白。     

外源lea3基因转化紫花苜蓿的研究

将来源于大麦的lea3基因通过基因枪法导入紫花苜蓿栽培品种“中苜一号”的胚性愈伤组织中,经过膦丝菌素类除草剂(PPT)的4次筛选获得抗性愈伤组织,诱导分化后共获得21株抗性再生植株。经叶片涂抹除草剂试验和lea3基因的PCR分子检测证明,lea3基因已整合到紫花苜蓿的基因组中。与对照植株相比,获得的转基因植株具有显著增强的耐盐能力,表明遗传转化lea3基因可用于苜蓿抗旱耐盐新品种的选育。     

球孢白僵菌不同分离株的生物学特性的研究

为了明确不同白僵菌菌株的生物学特征,对15株白僵菌菌株的ITS片段进行测序分析,并对这些菌株的菌落生长速率、产孢量、孢子萌发率、单芽管孢子萌发比例、单芽管平均长度和长芽管平均长度等多项生物学指标进行测定。结果表明,单芽管孢子萌发比例变化范围在11．91％～96．03％;单芽管平均长度和双芽管平均长度分别为6．28-21．43μm和10．338～19．902μm;各菌株间孢子萌发率差异很大,变化范围22．09％-86．32％。对菌株的培养特性（孢子萌发率、产孢量和菌落生长速率）与孢子萌发特性（单芽管孢子萌发比例、芽管总平均长度和芽管整齐度）这两个主因子进行典型相关分析,两性状集团总体相关不显著（P=0．341）,而孢子萌发率与单芽管孢子萌发比例相关显著,菌落生长速率与芽管总平均长度呈显著相关。     

棉花黄萎病拮抗细菌筛选与B-1O1菌株抗菌蛋白分离

棉花黄萎病（Cotton Verticillium wilt）是由大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）侵染引起的真菌性维管束系统病害,因该菌菌丝体产生的大量微菌核在土壤中存活时间长,寄主广泛,传播途径多,使得化学防治非常困难,且化学防治方法易污染环境、破坏生态平衡;另外病菌变异快,很难培育高抗病品系,且抗病品种存在选育年限长、抗性单一、有时农艺性状不如感病品种等问题。因此,采用基因工程手段向优良作物品种导入外源抗性基因,为抗病育种开辟了新的途径,达到这一目标的关键是分离有效的目的基因。     

草莓灰霉病菌的培养、毒素提取及生物测定

 草莓灰霉病菌(Botrytis cinerea Persoon)在25℃、pH3~4的Peberdy培养基中生长良好,并可产生引起草莓愈伤组织细胞死亡的毒素。产生毒素的高峰期为静置培养20天。灰霉菌发酵液中的毒素可用氯仿进行提取,经提取后的毒素液在269nm处有吸收峰。本研究建立了利用草莓愈伤组织细胞的荧光活性测定毒力的方法。