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根据GenBank中登录的布鲁菌(Brucella)omp31、bp26、omp10外膜蛋白基因序列,针对同一种病原,各设计合成了一对特异性引物,通过优化引物浓度组合,建立了检测布鲁菌472 bp、290 bp、162 bp片段的多重PCR快速检测方法。通过对该方法的特异性、敏感性和重复性试验,结果显示,该方法从布鲁菌标准菌株中扩增出了特异性的目的片段,而对大肠埃希菌等细菌的扩增结果均为阴性。经过对10倍倍比稀释的模板进行检测,多重PCR的敏感度为最低可检出1.1×10-3ng的DNA,在感染布鲁菌病奶牛乳汁模拟标本中最低可检出细菌数为80 cfu/mL。不同人员用该方法重复检测,结果均一致,表明重复性好。应用该方法对88份临床疑似布鲁菌感染的奶牛乳样进行了检测,结果检出17份阳性,阳性检出率约为19.3%。检测结果表明,该方法具有特异、敏感、重复性好等优点,可用于奶牛布鲁菌病的临床检测及流行病学监测等。 相似文献
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【目的】克隆鸡柔嫩艾美耳球虫SO7基因并进行原核表达,检测表达产物的免疫原性,为鸡球虫基因疫苗的制备奠定基础。【方法】以纯化的柔嫩艾美耳球虫杨凌(Eimeria tenella YL)株孢子化卵囊的总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增出E.tenella YL株的SO7基因,对其测序后进行序列分析。将SO7基因克隆到表达载体pET-32a中,构建pET-SO7重组质粒,并在大肠埃希菌BL21中诱导表达出重组蛋白,将重组蛋白纯化后免疫雏鸡,评价其免疫效果。【结果】鸡柔嫩艾美耳球虫SO7基因序列的开放阅读框(ORF)为651个碱基,共编码217个氨基酸。E.tenella YL株SO7基因与E.tenella LS18株、E.tenella BJ株、E.tenella GD株SO7基因ORF区序列相似性分别为99.1%,98.6%和99.1%,其氨基酸序列相似性分别为99.1%,98.6%和99.1%。SDS-PAGE分析表明,表达产物成功地表达出了分子质量为45ku的融合蛋白。各种抗球虫指标的测定结果显示,该蛋白对球虫感染鸡体具有一定的保护性。【结论】SO7基因具有很强的保守性,各虫株之间差异不大;重组蛋白具有一定的保护效果,适合用来制备基因疫苗。 相似文献
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根据GenBank发表的鸡柔嫩艾美耳球虫(Ei meriatenella)3-1E基因的ORF设计一对引物,用RT-PCR方法从E.tenella杨陵(YL)株总RNA中扩增3-1E基因,并将扩增产物与pMD18-T easy载体进行连接并测序,用DNAstar 5.0软件对测序结果进行分析。结果表明,2009年分离的E.tenellaYL株3-1E基因与其他虫株相比,核苷酸有9个位点发生变化,其中7个位点的变化引起了相应氨基酸位点的改变,其他2个位点的变化未引起氨基酸的改变。对2006年和2009年分离的YL株3-1E基因的核苷酸进行了比对,结果发现,有两个核苷酸位点发生了变化。系统发育树分析表明,E.tenellaYL株3-1E基因同种间与E.tenella甘肃株遗传关系最近,同属间与E.acervulina法国株遗传关系最近。 相似文献
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