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基于磁珠和双抗夹心免疫分析的Bt Cry1Ac毒素单链抗体筛选与鉴定 总被引:1,自引:0,他引:1
【目的】通过设计并优化生物素-亲和素标记磁珠筛选策略,建立针对Cry1Ac毒素的新型双抗夹心ELISA检测方法,为研究灵敏、快速的Bt毒素的检测方法建立一种新的检测模式。【方法】采用磁珠液相正负筛选方法,经过4轮筛选后,对每轮筛选后抗Cry1Ac毒素特异性结合噬菌体抗体的富集效果进行鉴定,通过单克隆ELISA方法从第4轮筛选得到的次级库中获得特异性结合Cry1Ac的阳性克隆,并对其进行PCR鉴定和DNA测序,确定有完整插入的scFv片段后进行后期相关试验。将相对结合活性最好的阳性克隆scFv-A12替换宿主菌HB2151中进行可溶性诱导表达并纯化。利用纯化后的scFv-A12作为“捕获抗体”,Anti-Cry1Ac兔多克隆抗体作为“检测抗体”,建立针对Cry1Ac的双抗夹心ELISA检测方法。【结果】以生物素化的Cry1Ac蛋白为包被原,利用噬菌体抗体库对其进行了4轮液相筛选。结果显示,相对产出率随着筛选轮数的增加而提高,第4轮较第1轮提高了42倍;单克隆噬菌体ELISA鉴定抗Cry1Ac噬菌体抗体,以试验孔OD450/阴性孔 OD450大于2.1为阳性标准,从第4轮筛选后的培养皿中随机挑选了300个菌落,经单克隆ELISA鉴定出6个阳性克隆,分别命名为hsCry1Ac-C5、hsCry1Ac-D8、hsCry1Ac-C12、hsCry1Ac-A12、hsCry1Ac-F9和hsCry1Ac-F4。其中,hsCry1Ac-A12具有相对较高的亲和力。对上述6个阳性克隆进行菌液PCR检测发现,在935 bp处均有明显的目的条带,通过对其进行测序和氨基酸序列比对,最终得到4株不同氨基酸序列的阳性克隆。hsCry1Ac-A12在成功替换宿主菌HB2151后,经1 mmol•L-1 IPTG诱导表达,于30℃条件下培养过夜。其表达产物经His Trap HP镍亲和柱纯化后SDS-PAGE检测,hsCry1Ac-A12蛋白分子量约为30 kD。通过方阵滴定对抗体浓度进行优化后,利用单链抗体为“捕获抗体”,多抗为“检测抗体”,建立了Cry1Ac双抗夹心ELISA检测方法。在1.25-2.43 μg•mL-1线性检测范围内,线性回归方程为Y=0.2522X+1.2832(R2=0.9564),检测限为1.08 ng•mL-1。【结论】利用磁珠液相筛选方法,建立了针对Cry1Ac毒素的双抗夹心ELISA检测方法,为快速、准确检测转基因食品中Cry1Ac提供了一种新的检测模式。 相似文献
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凝集素是一类能与糖及糖类物质特异性非共价可逆结合的蛋白质或糖蛋白,广泛存在于动植物和微生物体内。部分凝集素具有抗虫、抗菌、抗病毒以及靶向识别特定微生物种类等功能,因而成为农业绿色防控和食品防腐保鲜及致病微生物筛查检测领域研究的热点。本文系统梳理了国内外有关凝集素在农业病虫害防控、农业生产调节、食源性致病微生物防控及筛查检测等方面的应用研究状况,并探讨了其在这些方面的应用前景、存在问题及解决问题的对策,旨在为农业绿色防控和食品防腐保鲜及农产品质量安全检测研究提供最新的文献资料和思路。 相似文献
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果胶是木质材料中关注较少的化学成分,为了确定果胶在生物质材料中粘结细胞的关键作用,以实现利用果胶酶进行纤维分离。按照称重法、造纸原料-果胶含量的国家标准(GB/T 10742—2008)等测定方法,以工业大麻为对象,研究了不同生长期和植株性别中工业大麻杆的单株质量、果胶含量及果胶质量的变异特性。结果表明,大麻杆在整个生长周期19~186 d内,果胶含量在19.74%~5.68%范围内变化,随着生长天数增加而降低(p<0.000 1);果胶质量随着生长天数的增加而增加(p<0.000 1),质量范围为0.02~22.88 g;生长期相同时,雌株的果胶含量>雄株,约为0.1%~2.21%(p=0.000 5)。果胶主要存在于纤维胞间层和初生壁中,随着纤维细胞次生壁的逐步生成,果胶含量降低;但随着工业大麻秆生长期的延长,细胞数目的增加果胶质量增加。 相似文献
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为了建立检测Cry1B毒素蛋白质的双抗夹心时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)方法,利用稀土元素Eu3+作为示踪剂,以可溶性表达的抗Cry1B毒素蛋白质单链抗体(scFv)作为捕获抗体,以免疫兔血清获得的抗Cry1B毒素蛋白质多克隆抗体为检测抗体,建立检测Cry1B抗原的TRFIA技术,并对其进行方法学的综合评价。通过正交试验,获得的最佳单链抗体(Capture antibody)、多克隆抗体(Detection antibody)、Eu3+标记的二抗(Tracer antibody)浓度分别是2.500μg/ml、2.000μg/ml、1.000μg/ml。标准检测曲线灵敏度为0.170 ng/ml,线性测量范围为1.000~800.000 ng/ml。抗原类似物间无交叉反应。Cry1B毒蛋白质在大米中添加回收的批内变异系数为3.8%~6.6%、平均回收率为80.5%~84.8%,批间变异系数为2.2%~8.5%、平均回收率为84.1%~88.4%。表明本试验建立的双抗夹心Cry1B-TRFIA检测范围宽,特异性强,重复性和稳定性好。 相似文献
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病虫害严重威胁了农作物生长发育及农产品质量安全。农药是病虫害防治的关键,但长期滥用不仅加速了病虫害的抗药性,也给生态环境造成极大污染,合理用药是农业可持续发展的必然要求。农药联合复配是提升现有农药对靶标病虫害防治效率的最直接方式,同时通过复配可以减少药用量,也能提高农产品质量安全水平、延缓病虫害抗药性以及减少环境污染。农药联合复配是农药合理优化利用研究的热点。本文按化学-化学农药复配、生物-生物农药复配和生物-化学农药复配3种常规形式进行汇总归类,系统梳理近年国内外有关这3种形式的农药联合复配在常见农作物病虫害防治上的研究状况及典型应用实例;并就复配形式及其应用前景进行展望,特别对农药联合复配未来如何迈向更高效、更安全、更绿色的发展道路以及在探索过程中潜在的技术瓶颈等问题进行探讨、提出应对策略,同时也对农药复配在应用过程中所暴露的可能叠加危害生态环境和非靶标生物等问题表达关注;旨在为推进农药创新利用提供最新参考资料和潜在启发思路。 相似文献
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LC-MS/MS法研究甲磺隆和氯磺隆在不同条件土壤中的残留行为 总被引:1,自引:0,他引:1
在建立液相色谱三重串联四极杆质谱(LC-MS/MS)检测技术的基础上,采用PVC材料的圆柱形盆钵栽培方法,研究了不同土壤环境条件下甲磺隆和氯磺隆的残留特性.结果表明,甲磺隆和氯磺隆在水稻根际和非根际土壤中的残留量均呈不断下降趋势.处理后15d,根际和非根际土壤中两种农药残留量分别下降了44.7%和41.5%(甲磺隆)及38.7%和40.1%(氯磺隆),根际和非根际的残留差异不显著(P>0.05);处理后31d,残留量分别下降了77.7%和64.8%(甲磺隆)及62.7%和50.1%(氯磺隆),差异达极显著水平(P<0.01);处理后63d,残留量分别下降了96.4%和85.1%(甲磺隆)及90.0%和79.4%(氯磺隆),残留差异达极显著水平(P<0.01).甲磺隆的降解趋势和氯磺隆基本一致,但下降幅度比氯磺隆大.二者在水稻根际和非根际土壤中的残留量均符合一级动力学方程式C=G0e-λt(C代表浓度;C0代表初始浓度;t时间),决定系数范围在0.934 2~0.995 7之间.在种植水稻的条件下,下层土的农药残留量呈先上升后下降的趋势,处理后数日内达最高点,之后不断下降,122d后低于检测限.水稻下层土残留的从无到有说明农药在土壤中的淋溶可能是水田环境农药残留降解的原因之一.干旱土壤条件下,土壤的淋溶作用不明显.说明水旱轮作有利于农药残留在土壤环境中的降解. 相似文献