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利用CRISPR/Cas9系统构建敲除Prdx6基因的RAW264.7小鼠巨噬细胞系,为探讨Prdx6与布鲁菌感染及胞内寄生的关系构建细胞模型。针对Prdx6基因的第1外显子设计sgRNA,构建重组表达载体Prdx6-pX459-sgRNA,将重组质粒转染RAW264.7细胞,嘌呤霉素初步筛选。单细胞接种并扩繁,提取基因组DNA,PCR及测序鉴定。结果表明,在敲除细胞株基因组中存在碱基缺失,导致移码突变。说明成功获得敲除Prdx6基因的RAW264.7细胞系。 相似文献
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为研究IL-1β在布鲁氏杆菌(Brucella)侵染小鼠巨噬细胞过程中的表达情况,首先构建重组小鼠IL-1β原核稳定表达系统,免疫新西兰兔获得多克隆抗体,通过ELISA检测血清效价,并通过Western blot分析其活性,再以感染复数(multiplicity of infection,MOI)为1∶100(细菌∶细胞)建立猪种布鲁氏杆菌S2株侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7的模型,利用RT-PCR检测细菌侵染过程中IL-1β和MyD88 mRNA的变化水平;Western blot分析IL-1β在蛋白水平的变化。结果表明,重组蛋白IL-1β分子质量31 ku,多克隆抗体效价为1∶256 000,并且具有良好的特异性;与对照组相比,感染后IL-1β mRNA和IL-1β蛋白表达上调,胞内细菌数减少。猪种布鲁氏杆菌S2株侵染巨噬细胞IL-1β的表达量随时间变化并影响胞内活菌数。 相似文献
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