嗜水气单胞菌的分离与16S rDNA鉴定

[目的]分离并鉴定鱼嗜水气单胞菌,并构建系统发育分析.[方法]从云南某鱼场采集发病鱼的病变组织进行细菌分离与培养,并对分离菌株进行初步鉴定、16S rDNA鉴定和系统发育分析.[结果]分离培养到1株细菌,命名为Ah1305.经表型鉴定、生化试验及16S rDNA系统发育分析,鉴定为嗜水气单胞菌.[结论]该研究可为快捷、准确检测鱼嗜水气单胞引起的疾病提供参考.     

基于基因组的绒毛状烟草和林烟草microRNA及其靶基因分析

【目的】填补绒毛状烟草（Nicotiana tomentosiformis）和林烟草（Nicotiana sylvestris）在miRNA相关领域的研究空白,揭示普通烟草（Nicotiana tabacum）的生长发育调控机理。【方法】在绒毛状烟草和林烟草全基因组中预测并分析miRNA及其靶基因,通过同源比对及miRNA前体二级结构特征进行预测：参考序列在绒毛状烟草和林烟草基因组的比对中,允许最多1-2个错配;miRNA二级结构为经典茎环结构,其中MEF最大值为-25,MEFI最小值为0.85,预测的miRNA与已知的同一家族的miRNA位于发夹结构的同一条臂上;去除E值小于等于1e-6的编码蛋白的序列。【结果】在绒毛状烟草中得到39个家族的162条miRNA,包括14对正/反义miRNA和5个基因簇。在林烟草中得到40个家族的169条miRNA,包括13对正/反义miRNA和3个基因簇。2个野生烟草在保守度高的miRNA家族中,其成员分布相似,且成员数相近。在保守度相对较低的家族中,2个野生烟草其成员分布差异较为明显,其中,miR5021、miR5203等9个家族仅在绒毛状烟草中有成员,miR1446、miR1509等10个家族仅在林烟草中有成员。2种野生烟草的正义miRNA与反义miRNA都有着1-4个碱基差异,这些差异位点在不同的家族中呈现出偏好性,而且在2种野生烟草中偏好性相似：miR164家族的9、12、13个碱基处,miR172家族的1、21个碱基处,miR396家族的2、17个碱基处,miR399家族的15、20个碱基处。2种野生烟草的基因簇主要是由miR156、miR169家族组成,其前体的间距小于350 nt,同时在绒毛状烟草中首次发现miR6019/miR6020基因簇。以普通烟草的unigene数据库作为靶基因集进行预测与分析,在绒毛状烟草122条miRNA中得到749个靶基因,去掉重复基因得到非冗余靶基因206条,其中89条（43%）得到GO功能注释;在林烟草中117条miRNA得到650个靶基因,去掉重复基因得到非冗余靶基因169条,其中78条（46%）得到GO功能注释。在分子功能方面,大多数靶基因具有结合等活性。在生物学过程中,靶基因主要参与了发育过程、生殖过程、多细胞器官发育过程、胁迫应答过程等。【结论】控制发育和多细胞器官发育过程的靶基因数方面以林烟草居多,而胁迫应答的靶基因数以绒毛状烟草较多。     

细胞分化的甲基化调控及其分子机理

长期以来,对细胞分化过程的研究,尤其是对干细胞及其谱系的功能差异分析,主要集中在基因的转录水平调控。然而,越来越多的研究发现,DNA的甲基化、染色质重塑、基因组印记、染色体失活、非编码RNA作用等表观遗传学机制对哺乳动物发育、胚胎细胞分化及癌细胞增殖过程发挥着重要的作用。其中以DNA甲基化这种形式最为常见。作者就DNA甲基化对影响转录、分子调控、神经元发育、遗传等方面的最新研究成果进行综述。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因原核表达载体的构建与鉴定

本试验旨在构建能表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5基因的重组质粒。用疑似患猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病猪的脾脏、肺脏病料提取RNA,根据PRRSV ORF5基因设计1对引物,进行RT-PCR扩增,将ORF5目的基因克隆到pMD19-T载体中,得到pMD19-ORF5重组菌。根据测序结果和表达载体特点,设计1对带有NcoⅠ和XbaⅠ酶切位点的引物,扩增目的片段(dORF5),将其分别与pProEXHTb载体、pNZ8149载体连接,得到HTb-dORF5/DE3和pNZ8149-dORF5/NZ3900重组菌,分别用IPTG和Nisin诱导,再进行SDS-PAGE和Western blotting分析。结果显示,HTb-dORF5/DE3重组菌在1.5 mmol/L IPTG诱导时表达量最高,通过SDS-PAGE和Western blotting分析,在约22 ku处有特异性条带,且具有反应原性;pNZ8149-dORF5/NZ3900重组菌在20 ng/mL Nisin诱导时表达量最高,通过SDS-PAGE和Western blotting分析,在约19 ku处有特异性条带,间接免疫荧光试验有特异性绿色荧光。本研究成功构建重组质粒HTb-dORF5和pNZ8149-dORF5并获得表达,这为进一步研制预防PRRS疫苗奠定坚实基础。     

猪繁殖与呼吸综合征活疫苗中病毒含量荧光定量PCR测定方法的建立及初步应用

为建立快速、敏感、特异的评价猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）活疫苗中病毒含量的方法,根据GenBank中登录的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）基因序列设计合成了标准品引物和定量引物,RT-PCR扩增PRRSV基因片段并连接到pMD19-T载体上,构建标准品质粒pMD19-T-PRRSV。采用SYBR GreenⅠ染料法进行荧光定量PCR检测,分析标准曲线并进行特异性、稳定性、重复性试验。结果显示,该方法检测病毒含量为7.43×10⁰～7.43×10⁸拷贝/μL,标准品各稀释度质粒拷贝数与Ct值之间相关系数高(R²=0.9989),引物特异性强。应用该方法对6个厂家PRRS活疫苗中的病毒含量进行测定,发现不同厂家生产的疫苗中病毒含量差异较大,最高差异可达47.9倍。本试验建立的检测PRRS活疫苗病毒含量的荧光定量PCR方法可用于疫苗生产过程中及免疫动物前疫苗质量的评价。