乳牛布鲁氏菌病病原DNA快速检测技术的研究

在国内首次建立了乳牛原乳中布鲁氏菌外膜蛋白(OMP)25ku基因套式聚合酶链反应(nested—PCR)检测技术。结果显示，本方法的特异性好，只能扩增布鲁氏菌DNA，而不能扩增同样能引起乳牛流产的鹦鹉热衣原体、弓形虫、胎儿弯杆菌DNA；乳样的检测灵敏度达50CFU／mL，重复试验35次，可重复性和稳定性均十分理想；对4批331头凝集试验阳性(24份)或阴性(307份)乳牛的乳样用本方法检测，符合率为100％。在48h内即可获得诊断结果。本方法同样可用于血液或其他流产病料中布鲁氏菌DNA的检测。     

流产布鲁氏菌BCSP31基因在大肠杆菌中的可溶性高效表达

设计1对引物,突变除去布鲁氏菌BCSP31(细胞表面蛋白31)基因的N端信号肽氨基酸序列,经NotⅠ和EcoRⅠ酶切后与相同处理的表达载体pGEX-4T-1连接,转化BL21(DE3)感受态细胞。酶切及PCR扩增鉴定,获得阳性克隆,测序证明其阅读框完全正确。用IPTG诱导表达构建成功的阳性克隆,对产物进行SDS-PAGE和Western-blotting检测,发现表达产物出现预期分子量57 kD的融合蛋白,该蛋白能与牛流产布鲁氏菌阳性血清发生反应,进一步证明目的蛋白主要以可溶性形式存在,表达量约占总蛋白的40%,应用GST琼脂糖凝胶FF纯化可得到纯度较高的表达产物。     

脉冲放电杀菌技术及其应用研究进展

脉冲放电杀菌技术是一种利用电压瞬间发生变化而对细菌产生不可逆损失,进而导致死亡的一种非热杀菌技术。论文综述了脉冲电场的杀菌机理、特点和杀菌效果以及其在国内外应用的研究进展,提出脉冲放电杀菌技术有望取代传统的化学试剂灭活病原体方法,为动物传染病病原体的灭活和疫苗的制备带来革新。     

奶牛布病与衣原体病混合感染的PCR诊断

本文采用PCR技术对发生在甘肃某奶源基地一奶牛场的群发性怀孕母牛流产进行病原检测,证明是此次流产由布鲁氏菌和衣原体混合感染所致.     

羊流产衣原体的分离鉴定及间接免疫荧光法检测

对收集的疑似衣原体感染的羊流产胎儿样本接种鸡胚卵黄囊进行分离培养,通过PCR-RFLP(限制性片段长度多态性分析)方法鉴定为流产衣原体。将收集到的流产衣原体阳性样本接种Hela229细胞,应用基于流产衣原体MOMP单克隆抗体的间接免疫荧光法,在Hela229细胞浆内可见呈绿色荧光的衣原体包涵体,进一步在病原学水平上确定发生在甘肃省肃南县羊流产的病原为流产衣原体。     

我国部分地区肉用牛群衣原体病的血清学调查

１９９７￣１９９８年从山东、河北、河南、陕西、宁夏、甘肃、青海和四川等８省（区）部分地区采集肉用牛、肉役兼用黄牛及牦毛血清样品６４２份，用间接血凝试验检测衣原体抗体。结果：肉用牛平均阳性检出率为３２．６％（１３．６％￣７２．７％）；牦牛为１８．７％（１０．－     

规模化猪场猪衣原体病的监测

由鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)感染猪引起的猪衣原体病,在临诊上表现出不同症状,包括怀孕母猪流产、死产、胎儿干尸化,产弱仔,公猪睾丸炎,仔猪肺炎-肠炎,结膜角膜炎,多关节炎及脑炎等,如果病原的毒力较弱,受感染的动物也可能不表现症状而呈隐性感染状态.但随着时间推移,毒株在猪体自然传代,毒力增强,在外界气候突变,饲养密度高,通风不良,卫生条件差等不利应激因素的刺激下,猪群可能突然暴发衣原体病[1],造成较严重的经济损失.     

牛病毒性腹泻病毒牦牛分离株E0基因的克隆表达

将青海牦牛牛病毒性腹泻病毒(BVDV)青海泽库(QHZK)株的E0基因亚克隆入原核表达载体pET-32(a),构建了重组表达载体pET-32(a)-E0,然后用重组质粒转化Rosetta(DE3)感受态细胞,并利用IPTG诱导蛋白表达。表达的蛋白用His-Band镍柱进行亲合层析纯化,Western blot鉴定表达蛋白。结果显示,E0基因可在大肠埃希菌中获得表达,表达产物的分子质量约为44ku,与预期的蛋白分子质量大小一致;Western blot分析表明,该蛋白可以与BVDV标准阳性血清产生特异性结合反应。     

L929细胞无血清悬浮驯化机器在流产衣原体灭活疫苗中的应用研究

为了给规模化生产流产衣原体提供悬浮细胞培养方法,本研究通过逐步降血清悬浮驯化法使贴壁L929细胞逐步适应悬浮培养环境,最终获得了一株可无血清悬浮培养的L929细胞株;将流产衣原体接种于L929悬浮细胞上,研究不同的促感染试剂以提高收菌量,并选择出最佳的培养方法;制备流产衣原体灭活疫苗,以25 μL 、50 μL、100 μL的剂量免疫Balb/c小鼠,攻毒后检测其免疫保护效果。结果显示,当该L929悬浮细胞初始接种密度为5×105个/mL 时,培养72 h后细胞浓度可达到约7×106个/mL,细胞活力在95%以上;在细胞密度为6×106个/mL,接菌量为5.5×104 IFU/mL,加入脂质体2000的量为1.7 μL/mL、放线菌酮浓度为0.4 μg/mL时,菌量增殖倍数最大,48 h内约扩增了52倍。经流产衣原体悬浮细胞灭活疫苗免疫后,小鼠产生的抗体水平随免疫剂量的增加而提升;接种50 μL、100 μL疫苗组小鼠的脾淋巴细胞增殖水平、IFN-γ、IL-2的含量远高于接种25 μL疫苗和注射PBS组的小鼠;对免疫后的小鼠进行攻毒,接种疫苗组小鼠的脾脏、十二指肠、子宫中的流产衣原体基因组含量远低于未接种疫苗组小鼠。注射PBS组及接种25 μL疫苗组的小鼠子宫出现了不同程度的坏死及炎症,而其余两组小鼠的子宫无异常变化。结果表明,本试验成功驯化出１株L929悬浮培养细胞株,并且通过悬浮培养工艺制备的流产衣原体灭活疫苗免疫效果良好,接种50 μL、100 μL该灭活疫苗可以有效抑制流产衣原体的感染,该L929细胞全悬浮培养株的成功驯化为疫苗规模化生产提供了科学依据。     

D型产气荚膜梭菌ε毒素基因表达及其免疫保护作用的初步研究

利用PCR技术,从D型产气荚膜梭菌标准株(C60-2)染色体DNA中扩增出ε毒素基因。该基因产物大小为906 bp,序列分析结果表明,与GenBank报道的产气荚膜梭菌参考菌株ε毒素基因序列同源性大于99%。将扩增的ε毒素基因定向克隆到原核表达载体pET32a中,得到重组质粒pET32a-ETX,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)plys中,经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析可见大小为54 ku的特异条带;经Western blotting和ELISA检测结果表明,表达的ε毒素能与抗天然ε毒素抗体发生特异性反应,说明ε毒素蛋白具有较好的反应原性。将表达的ε毒素蛋白用0.4%的甲醛溶液制成类毒素疫苗,免疫小鼠后,具有一定的保护力,这表明该重组菌株有望成为产气荚膜梭菌基因工程类毒素疫苗的候选菌株。