黑尾叶蝉RNAi途径关键蛋白AGO2多克隆抗体制备及应用

[目的]制备效价高且特异性强的黑尾叶蝉RNAi途径关键蛋白Argonaute 2(AGO2)多克隆抗体,为进一步研究AGO2蛋白在叶蝉RNAi免疫途径中的调控功能及作用机制提供技术支持.[方法]通过RT-PCR从黑尾叶蝉基因组扩增出AGO2基因的功能片段,与原核表达质粒pET-28a重组构建重组质粒,然后转化大肠杆菌BL21感受态细胞进行诱导表达;以纯化的AGO2融合蛋白免疫雄性新西兰大白兔获得高效价的多克隆抗体,并以多克隆抗体为一抗,采用Western blotting检测AGO2蛋白在健康和带毒黑尾叶蝉中的表达情况.[结果]RT-PCR扩增获得的黑尾叶蝉AGO2基因片段为1635 bp,构建的pET-AGO2重组质粒能在BL21感受态细胞中成功表达出AGO2融合蛋白,其最适表达条件:温度28℃,IPTG浓度0.5 mmol/L,诱导时间5 h,摇床转速220 r/min.以纯化AGO2融合蛋白免疫雄性新西兰大白兔获得的多克隆抗体效价为1:106,抗体浓度约350μg/mL.Western blotting检测结果表明,AGO2蛋白在健康和水稻矮缩病毒(RDV)感染黑尾叶蝉中均有表达,但与健康黑尾叶蝉相比,AGO2蛋白在RDV感染黑尾叶蝉中的表达水平更高,即RDV侵染能提高AGO2蛋白的表达水平.[结论]制备获得的黑尾叶蝉RNAi途径关键蛋白AGO2多克隆抗体具有高纯度和高效价,且特异性强,可用于检测AGO2蛋白在病毒感染黑尾叶蝉中的表达水平,进而揭示AGO2蛋白在介体昆虫RNAi途径中的功能机制.