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为研究绵羊肺腺瘤病病毒(JSRV)表面蛋白(SU)的致瘤机制,本研究构建稳定表达SU的羊肺细胞A549细胞系.采用PCR方法从含su基因的pGEX-4T-1-SU重组质粒中扩增SU编码序列,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,转染A549细胞.通过G418筛选,对转染阳性细胞进行纯化,获得稳定表达JSRV SU蛋白的A549细胞系.以间接免疫荧光及western blot鉴定SU的表达状况,并运用共聚焦显微镜确认SU蛋白的亚细胞定位.结果表明,重组蛋白SU在A549细胞中有效表达,而且主要分布于细胞质中.该细胞系的建立为SU生物学功能的体外研究提供了平台. 相似文献
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参照内源性绵羊肺腺瘤病毒株enJSRV-20全基因组序列设计合成3对引物,应用PCR技术扩增内源性绵羊肺腺瘤病毒基因片段分别连接pMD-18T载体并测序,完成了内源性绵羊反转录病毒基因组序列测定。分析结果显示,测定序列全长7519bp,与内源性绵羊肺腺瘤病毒代表株enJSRV-20核苷酸同源性为99.4%,与外源性绵羊肺腺瘤病毒代表株AF357971.1的核苷酸同源性为90.4%。基于全基因组序列核苷酸的系统进化发生树分析结果显示,扩增序列与enJSRV-20的亲缘关系最近。 相似文献
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绵羊肺腺瘤病毒囊膜基因表面蛋白的表达及其单克隆抗体的制备 总被引:1,自引:1,他引:1
在E.coli BL21中诱导表达含有绵羊肺瘤病毒囊膜表面蛋白(SU)重组质粒pGEX-4T-1-SU,表达的GST融合蛋白经纯化后用佐剂乳化,作为抗原免疫BALB/c小鼠,并进行细胞融合、克隆化、ELISA法初步筛选抗SU单抗。最终获得了3株抗SU的单抗,为深入探讨JSRV的分子生物学特性及研制诊断试剂盒打下了基础。 相似文献
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参照内源性绵羊肺腺瘤病毒株enJSRV-20(EF680302.1)全基因组序列设计合成3对引物,以山羊基因组DNA为模板,应用PCR技术扩增山羊内源性病毒基因片段,分别连接PMD-18T载体并测序,完成了1株山羊内源性肺腺瘤反转录病毒全基因序列的测定。结果分析显示测定序列全长7 480bp,获得的序列与内源性绵羊肺腺瘤病毒株enJSRV-18(EF680301.1)的核苷酸相似性为93.4%,与外源性绵羊肺腺瘤病毒株JS-7(AF357971.1)的核苷酸相似性为88.1%。根据pro基因序列构建系统进化树,结果显示扩增序列与内源性绵羊反转录病毒株en-JSRV-5(EF680305.1)的亲缘关系最近。本研究有助于内源性肺腺瘤反转录病毒感染性克隆的构建和内源性肺腺瘤反转录病毒功能的研究。 相似文献
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马传染性贫血病毒受体基因的原核表达 总被引:1,自引:0,他引:1
为了构建马传染性贫血病毒受体(ELR1)的原核表达体系,克隆ELR1的编码区基因,将其亚克隆到PET-30a构建重组表达质粒PET-30a-ELR1,经酶切和DNA测序鉴定,将阳性质粒转化E.coli BL21感受态细胞,IPTG诱导,表达产物经SDS-PAGE电泳及Westhern-blot分析鉴定,结果表明:该基因在大肠杆菌中以包涵体形式表达,其表观分子质量约为39.6 ku;利用尿素洗涤纯化可以得到具有较高纯度的表达蛋白,是一种理想的免疫原. 相似文献
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为深入研究绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)与绵羊肺腺瘤病(OPA)发病关系,本研究采用PCR方法从pGEX-4T-1-TM重组质粒中扩增编码JSRV跨膜蛋白(TM)的基因序列,并引入标签多肽HA序列和限制性内切酶位点,将其重组至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建了重组质粒pcDNA-TM-HA.通过转染HepG2细胞并用G418筛选,对稳定表达TM的阳性细胞进行纯化,获得了稳定表达JSRV tm基因的HepG2细胞系.间接免疫荧光及western blot检测结果表明,重组蛋白TM-HA在HepG2细胞中得到正确表达.JSRV TM蛋白稳定表达细胞系的建立为进一步研究该蛋白与JSRV诱导OPA发病关系提供了重要的实验平台. 相似文献
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对JSRV感染羊及健康绵羊H-ras、N-ras、K-ras基因第一、二外显子区克隆并测序,研究其变异状况.方法:本研究从JSRV感染羊及健康绵羊肺组织中提取基因组DNA,应用PCR技术扩增Hras、Nras、Kras基因第一、二外显子序列,并通过T-A克隆的方法将其克隆入pMD - 18T载体中,鉴定为阳性的重组质粒进行序列测定分析.结果:与其他物种ras基因相比,所克隆的ras基因与其他物种之间的差异率较小,基本保守,且与牛的ras基因同源性最高.所克隆的H -ras、K-ras基因在第一、二外显子区域序列完全相同;N-ras第81位氨基酸A-V的不同;但试验中检测的2例JSRV感染羊与健康绵羊的ras无论是在核酸水平上,还是在氨基酸水平上均未发现突变.结论:克隆测序了绵羊ras基因第一、二外显子,为下一步实验奠定了基础. 相似文献
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