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传染性法氏囊病毒VP2蛋白的高效表达与免疫原性分析 总被引:1,自引:0,他引:1
为了实现传染性法氏囊病毒(IBDV)B87毒株VP2蛋白在大肠杆菌中的高效可溶性表达,将IBDV B87毒株VP2基因插入原核表达载体p ET-28a(+),构建重组质粒p ET28a-VP2,将其转化不同大肠杆菌基因工程菌株,通过IPTG诱导表达VP2外源蛋白。利用鸡传染性法氏囊病抗原快速检测试纸筛选,确定了BL21(DE3)为VP2可溶性蛋白的高效表达菌株。SDS-PAGE、Western blot分析表明,VP2实现了可溶性表达,且可溶性VP2蛋白具有良好的反应原性。将表达的重组蛋白利用琼脂扩散试验(AGP)分析,结果表明,VP2蛋白的AGP效价达到1∶64。将重组蛋白免疫接种SPF鸡,制备的抗血清AGP效价可达1∶16,说明表达的B87毒株VP2蛋白免疫原性良好。 相似文献
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为了评估猪流行性腹泻病毒(PEDV)S1蛋白的免疫原性,利用果蝇胚胎S2细胞表达重组S1蛋白,将纯化的S1蛋白免疫4周龄昆明小鼠,收集免疫血清及脾淋巴细胞,通过ELISA、病毒中和试验和流式细胞术等方法分析表达的重组S1蛋白的免疫原性。结果显示,与对照组(PBS)相比,重组PEDV S1蛋白免疫组小鼠血清中特异性IgG抗体水平显著提升;二免后14 d,果蝇细胞重组PEDV S1蛋白免疫组小鼠的中和抗体效价达到1∶320;免疫后小鼠脾脏淋巴细胞具有更强的增殖能力;外周血CD3+T细胞百分比显著增加,CD4+/CD8+T细胞比值高于对照组;小鼠血清中IL-4、IFN-γ水平显著上升。综上,成功表达了重组PEDV S1蛋白,其可以诱导小鼠产生高效价的中和抗体,促进细胞免疫应答。 相似文献
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以原核表达经纯化复性制备的A型口蹄疫病毒(FMDV)VP1蛋白代替传统病毒抗原包被,建立快速、安全、有效的A型FMDV抗体ELISA检测方法。对前期制备的A型VP1蛋白进行Western-Blot检测,结果表明,VP1蛋白能够特异性识别A型FMDV阳性牛血清,可作为检测抗原建立检测A型FMDV抗体的方法。以最佳质量浓度1mg/L VP1蛋白为检测抗原,方阵滴定法确定最佳检测血清稀释度为1∶50[V(血清)∶V(封闭液)],最佳的酶标二抗稀释度为1∶2 000[V(酶标二抗)∶V(封闭液)],建立A型FMDV抗体ELISA检测方法。该方法的敏感性为94.32%,特异性为99.09%,批内与批间重复试验变异系数均小于8%。采用该方法检测201份临床血清,与液相阻断ELISA试剂盒的符合率达92.54%。研制的VP1-ELISA试剂盒特异、敏感、稳定、操作简便,可用来监控A型口蹄疫抗体水平。 相似文献
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为分离鉴定流行于河南省的猪圆环病毒2型(PCV2),对河南省不同地区猪场的11份疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)猪的病料进行分离鉴定,得到PCV2毒株。通过PCR检测,11份临床疑似病料中,7份确诊为PCV2阳性病料,阳性率为63.6%。挑选出阳性值较高的毒株命名为zmd-20161022,通过增殖培养筛选出优良毒株,并对其进行单层过氧化物酶试验(IPMA)鉴定,分析免疫原性;应用PCR对该病毒全基因组进行特异性扩增,经测序后对该病毒的同源性和系统进化进行分析。结果显示,该毒株序列全长1 767 bp,同源性分析发现与国内3株PCV2毒株(AY686763、HM641752、HM038034)的同源性为95.2%~98.3%,与基因登录号为HM038030.1的同源性高达98.6%。系统进化树分析发现,zmd-20161022毒株与基因登录号为HM038030.1的亲缘关系很近,被鉴定为PCV2b-1c型,属于PCV2b的一种亚型。 相似文献
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为了解猪流行性腹泻病毒(PEDV)新流行毒株的遗传变异情况,本研究对2014—2018年间采集的205份PEDV疑似阳性样品进行RT-PCR检测、扩增PEDV S2基因并进行遗传转化分析。RT-PCR结果显示,205份疑似阳性样品中有191份扩增出单一条带,片段大小为1 887 bp,符合S2基因的扩增预期。试验样品阳性检出率为93. 17%。测序分析表明,试验共获得25株S2基因序列,与参考毒株之间核苷酸的同源性为94. 3%~99. 6%,氨基酸的同源性为86. 4%~96. 2%。遗传进化分析结果显示,试验得到的PEDV毒株分属于G1、G2亚群。本研究为PEDV防控以及疫苗毒株筛选奠定基础。 相似文献
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【目的】建立口蹄疫病毒(FMDV)感染与免疫鉴别诊断及免疫评价二联试纸稳定的生产工艺,促进其产业化生产及临床应用。【方法】本研究以胶体金免疫探针结合猪IgG,FMDV结构蛋白(SP)及非结构蛋白(NSP)的表位多肽偶联载体蛋白制备人工抗原,设置两条检测线精准拦截抗体的检测模式,以试纸条特异性及敏感性为评价指标,对胶体金免疫探针用蛋白、试纸拦截用多肽抗原、检测线位置及喷膜缓冲液、金标蛋白保存液、样品垫缓冲液以及样品稀释液等参数进行优化。采用优化后的试纸检测266份田间猪血清样品,并与口蹄疫O型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒(LPB ELISA)和3ABC阻断ELISA抗体检测试剂盒(3ABC ELISA)检测结果进行对比,计算该试纸与商品ELISA试剂盒的符合率。【结果】经优化后,口蹄疫感染与免疫鉴别诊断及免疫评价二联试纸生产工艺参数如下:以胶体金标记金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)为免疫探针;选择混合多肽的形式设置拦截线,以非结构蛋白多肽(BSA-NSPs)喷涂T1线,结构蛋白多肽(BSA-SPs)喷涂T2线,以0.1 mol/L Tris-HCl为喷膜缓冲液;以ddH2 相似文献
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试验旨在探究葡萄糖调节蛋白78(glucose regulatory protein 78,GRP78)基因的理化性质和结构特点,阐述GRP78在猪流行性腹泻病毒复制中的分子伴侣作用和调控机制。通过RT-PCR方法扩增GRP78基因,并插入到pMD20-T Simple载体进行克隆测序,利用生物信息学方法对其氨基酸序列、跨膜结构、糖基化位点、磷酸化位点、三级结构等进行预测和分析。将GRP78基因插入pCDNA 3.1中,然后转染Vero-E6细胞。Western blotting检测Vero-E6细胞中GRP78的表达。生物信息学分析结果表明,GRP78基因全长1 965 bp,编码654个氨基酸,蛋白质分子质量为72.33 ku,理论等电点为5.07,分子式为C3189H5153N865O1019S13。遗传进化树分析显示,猴源GRP78基因与双峰驼、犬、猫、大猩猩、蝙蝠、狒狒、猪、马的氨基酸序列同源性为99.5%~99.8%;遗传进化分析显示,大猩猩和狒狒亲缘关系最为接近。跨膜区和信号肽预测结果显示,该蛋白存在信号肽但不存在跨膜结构。GRP78蛋白无N-糖基化修饰位点,存在6个O-糖基化位点、28个磷酸化位点,表明GRP78可能有与激酶磷酸化有关的PKC、PKA特异性蛋白激酶的结合位点,可能参与己糖代谢和单糖代谢。 相似文献
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旨在通过引入信号肽序列实现猪瘟病毒E2蛋白在杆状病毒表达系统中的高效表达。首先将内源信号肽(简称endo)、蜂素信号肽(简称mel)及gp67信号肽(简称gp67)分别引入pFastBac1载体,随后插入E2基因,构建重组质粒。随后将重组质粒转化至DH10Bac感受态细胞,经蓝白斑筛选得到重组黏粒,将重组黏粒转染sf21细胞以得到杆状病毒。经扩增后大量感染细胞,检测E2蛋白表达情况,利用镍填料纯化得到E2蛋白,并进行蛋白糖基化水平鉴定及蛋白免疫原性分析。PCR鉴定结果显示成功构建了重组质粒。挑选白斑进行PCR鉴定,证实得到重组黏粒。Western blot检测结果表明,E2蛋白实现了分泌表达,进一步比较细胞培养上清中E2蛋白的表达水平,确定gp67信号肽介导的E2蛋白分泌表达量最高。经镍填料纯化得到E2蛋白,SDS-PAGE结果显示其纯度较高,产率为25 mg·L-1。通过ELISA分析其抗原性,结果表明纯化所得E2蛋白能特异性识别猪瘟阳性血清中的抗体,其抗原性良好。将纯化后的E2蛋白添加ISA201佐剂乳化后免疫BALB/c小鼠,阻断ELISA结果显示,免疫后14 d即产生较高水平的猪瘟特异性抗体,表明E2蛋白免疫原性良好。本研究为E2亚单位疫苗的研制奠定了基础。 相似文献