随机突变对扩展青霉脂肪酶最适作用温度的改善

利用error-prone PCR和staggered extension process(StEP)相结合的方法对扩展青霉脂肪酶(PEL)进行定向进化,构建含有随机突变基因的重组质粒pPIC3.5K-lip-mutantx,电转化引入毕赤酵母GS115中,进行异源表达。高通量筛选获得一株最适作用温度比野生型提高了5℃的突变株。15%的SDS-PAGE表明突变体分子量与野生型一致,约为28kDa。基因测序结果表明,突变体第270位丙氨酸变为苏氨酸,后者是氢键的供体,能形成具有稳定空间结构的氢键,使酶结构更加稳定,在高温下更适于与底物结合。     

脂肪酶的固定化及其在生物柴油制备中的应用

脂肪酶(lipase EC 3.1.1.3)又称三酰基甘油酰基水解酶,属于特殊的水解酶,它的天然底物是油脂,除了具有高催化效率、专一性、无污染性等生物酶的一般特性外,一个突出的特点是在异相体系中具有催化活性,即在油水界面能够催化酯水解或醇解、氨解、酯合成、酯交换、内酯合成、高聚物合成以及手性药物的拆分等反应[1].     

易错PCR对扩展青霉脂肪酶基因PEL的定向进化

以带有野生型扩展青霉碱性脂肪酶eDNA全长的载体psk—lip07为模板,利用易错PCR技术以及高通量筛选,最终获得了一株最佳突变体CS—pPIC3．5K—lip07-ER04,其最适作用温度比野生型提高10℃,酶活提高了约22％,热稳定性Tm值也提高了3．28％。基因测序结果表明,脂肪酶（PEL）第82位的Lys突变成Arg,第241位的Glu突变成Pro。