一步法快速构建长片段RNAi发夹的载体

利用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术可以进行基因功能研究以及作物遗传改良,但常规构建RNAi载体方法费时费力.本研究报道了一种基于USER酶一步法快速构建RNAi发夹结构的载体2301/RNAi/OS及其应用方法,操作简便,省时省力.与已报道的利用酶切连接、Gateway兼容的同源重组或PCR直接连接等构建RNAi载体相比,该载体不需要酶切片段,片段扩增完成后即可与制备好的线性化载体进行反应,缩短操作流程和时间,提高成功率;该载体对插入片段的酶切位点和长度没有要求,理论上任何位置和长度的片段均可进入2301/RNAi/OS载体中,尤其是长片段RNAi的构建.本试验以本氏烟(Nicotiana benthamiana)PDS(Phytoene desaturase)基因为例,利用农杆菌介导的瞬时表达体系验证了该RNAi能够在植物体内有效地实现基因沉默.该载体以新霉素磷酸转移酶基因(NPTII)作为筛选标记基因,可以利用卡那霉素(Kanamycin)和G418(Geneticin)等抗生素筛选转基因阳性植株,适合单子叶和双子叶植物的遗传转化.     

圆锥绣球‘石灰灯’种子形态及萌发特性研究

针对圆锥绣球‘石灰灯’(Hydrangea paniculata‘Limelight’)种子形态特征及萌发特性,测定了种子大小、含水量、吸水率,并研究了贮藏温度与消毒方法对种子萌发的影响。结果表明：‘石灰灯’种子不存在形态及物理休眠。种子成熟时胚发育完全,种皮透水性良好。初始含水量为4.3%,96 h时吸水达饱和状态,吸水率为37.7%;随着贮藏温度下降,种子发芽率呈上升趋势,超低温(-70℃)处理下发芽率最高(12.7%),且污染率最低(41.3%);不同消毒方式下,75%C₂H₅OH处理组中,种子污染率随消毒时间延长而显著降低,以消毒90 s效果最好,种子污染率和发芽率分别为16.0%和17.3%;15%NaClO处理组中,虽然种子污染率与发芽率随着消毒时间的延长差异不显著,但处理3 min的效果最佳,种子发芽率和污染率分别为22.7%和14.3%。     

烟草黑胫病的诊断及综合防治技术

烟草黑胫病是一种分布广泛、为害严重的世界性烟草主要病害。可为害烤烟、晾烟、晒烟、白肋烟、香料烟等所有的栽培烟草。自从19世纪末期从印度尼西亚发现以来,该病流行     

会计电算化应用中的风险及对策

会计电算化是传统会计信息处理技术的重大变革。它的推广应用正朝着企业资源计划管理系统“ERP”(企业管理软件)和政府资源规化“GRP”(政务管理软件)方向发展。但由于财会工作自身的特点,现阶段我国会计电算化工作缺乏统一的规划和组织协调,内部控制制度仍不十分完善,存在着许多问题及潜在的风险。     

会计电算化应甩中的风险及对策

会计电算化是传统会计信息处理技术的重大变革。它的推广应用正朝着企业资源计划管理系统“ERP”（企业管理软件）和政府资源规化“GKP”（政务管理软件）方向发展。但由于财会工作自身的特点，现阶段我国会计电算化工作缺乏统一的规划和组织协调，内部控制制度仍不十分完善，存在着许多问题及潜在的风险。[第一段]     

棉花钠尿肽基因GhPNP1的耐旱功能分析

【目的】分析棉花中钠尿肽GhPNP1的结构特征、表达模式以及耐旱功能,并分析其耐旱机制,为将该基因应用于作物改良奠定基础。【方法】通过对从植物中水平转移到大丽轮枝菌中的钠尿肽基因AVE1进行同源性搜索,得到与AVE1蛋白序列相似度较高的其他物种的蛋白序列;使用MEGA5软件对AVE1蛋白序列及其同源序列进行多序列比对分析并构建同源物种间系统进化树;利用MEGA和expasy在线工具进行蛋白序列分析;并根据编码该蛋白的核酸序列设计引物在陆地棉品种奥3503中克隆到其同源基因GhPNP1。使用多种生物信息学软件分析GhPNP1的分子特性,包括GhPNP1编码蛋白的等电点、分子量、信号肽、进化关系等进行预测分析。利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析GhPNP1在不同器官部位的组织表达模式以及受到PEG模拟干旱胁迫处理后的表达模式。将GhPNP1的cDNA序列连入CLCrV沉默载体中,构建GhPNP1的病毒诱导基因沉默载体CLCrV:GhPNP1,转入农杆菌,并通过和辅助载体CLCrVB共侵润2叶期幼苗进行叶片注射,获得GhPNP1的沉默植株。利用PEG模拟干旱处理沉默植株检测其耐旱性,并测定沉默植株的失水率、相对含水量、丙二醛（MDA）含量、总抗氧化活性（T-AOC水平）、离子渗漏率等与植物抗逆相关的生理指标。【结果】从陆地棉奥3503中克隆到的GhPNP1的开放阅读框长度为396 bp,编码131个氨基酸,信号肽长度为15个氨基酸,通过系统进化树分析GhPNP1编码的蛋白含有保守的钠尿肽结构域,与可可树的PNP蛋白进化关系最近。GhPNP1在棉花植株的根、茎、叶中均表达且在茎中表达量较高,PEG模拟干旱处理后根、茎、叶中的GhPNP1均上调表达。GhPNP1沉默后棉花植株耐旱性显著降低。在干旱条件下,GhPNP1沉默植株的MDA含量、离子渗漏率、叶片失水率均高于对照的未沉默植株;而沉默植株的总抗氧化能力（T-AOC水平）、相对含水量显著低于对照的未沉默植株。【结论】从棉花中克隆得到一个植物钠尿肽基因,受干旱胁迫诱导上调表达,沉默后耐旱性降低。推测GhPNP1可能通过cGMP信号途径参与棉花的干旱胁迫,在干旱胁迫下对棉花耐旱性起正调控作用。     

盾叶薯蓣主要病害的识别及其防治

盾叶薯蓣(Dioscorea Zingiberensis C.H.Wright),别名黄姜,为薯蓣科薯蓣属多年生缠绕植物,以根状茎入药,所含薯蓣皂甙元(简称皂素)是合成肾上腺皮质激素、蛋白同化激素     

棉花FAR1/FHY3基因家族的全基因组分析

【目的】FAR1/FHY3是1类起源于转座子酶的转录因子,在光敏色素A(phyA)信号通路的启动中起到非常重要的作用。通过对FAR1/FHY3家族进行全基因组学分析,为深入研究FAR1/FHY3在棉花光信号通路中的分子调控机理提供基础。【方法】利用生物信息学方法对亚洲棉(Gossypium arboreum L.)、雷蒙德氏棉(Gossypium raimondii Ulbrich)和陆地棉(Gossypium hirsutum L.)中的FAR1/FHY3基因进行了全基因组鉴定和分析。【结果】共鉴定出88个FAR1/FHY3基因,其中陆地棉中数量最少。聚类分析将所有成员分为3个亚组。Ka/Ks值表明大部分基因都经历了负选择过程。转录组数据分析发现,大部分FAR1/FHY3基因在棉花叶片中表达,少数在茎、花瓣和花托中表达。陆地棉中的Gh FAR14在4种组织中均有较高水平的表达,且与拟南芥FHY3具有较高的同源性,推测其在陆地棉phyA信号通路的启动过程中可能起到关键作用。【结论】该研究结果有助于了解棉花FAR1/FHY3基因家族的进化与功能,为下一步深入研究该基因家族在棉花生长发育和响应红光信号通路中的分子调控机理提供基础。     

番茄抗黄化曲叶病毒病相关基因ClNLR 的功能分析

 在前期通过转录组研究发现1 个NBS-LRR 类抗病基因（Solyc05g009760.1）在抗TYLCV 番茄材料‘CLN2777A’中上调表达，推测可能参与抵抗TYLCV 侵染的防卫反应的基础上，以‘CLN2777A’ 番茄为材料，通过RT-PCR 克隆该基因全长cDNA 序列，命名为ClNLR。荧光定量PCR 发现ClNLR 在番 茄‘CLN2777A’的根和叶片中高水平表达。ClNLR 在本氏烟叶片上的瞬时表达诱导了过敏性反应。病毒 诱导的基因沉默（VIGS）抑制ClNLR 基因在抗病番茄‘CLN2777A’中表达后，接种TYLCV，检测叶片 带毒量，发现VIGS 处理的番茄植株体内的TYLCV 积累量与其ClNLR 基因表达水平成反比。这些研究结 果表明ClNLR 可能为抗番茄黄化曲叶病的相关基因。     

棉花干旱诱导MYB类转录因子GhRAX3的功能分析

【目的】挖掘、分析响应干旱诱导的MYB转录因子的功能,为棉花抗旱研究和育种提供参考。【方法】以已知受干旱诱导表达的GbMYB5为检索项,Blastx检索NCBI的非冗余蛋白nr数据库中与GbMYB5具有相似序列的棉花MYB转录因子,通过荧光定量PCR验证获得干旱应答相关的MYB转录因子GhRAX3。将GhRAX3-GFP融合蛋白表达载体通过农杆菌注射法在烟草叶片瞬时表达,观察亚细胞定位荧光信号。将棉花曲叶病毒CLCrV介导的基因沉默载体CLCrV﹕GhRAX3通过农杆菌浸润法注射棉花子叶,荧光定量PCR检测棉花GhRAX3表达水平,对GhRAX3沉默的棉花植株进行干旱胁迫处理,观察表型变化,并检测其叶片失水率、叶片含水量、总抗氧化物酶活性、丙二醛含量和离子渗透率等抗旱相关生理指标。【结果】Blastx检索结果发现,与GbMYB5相比,GhRAX3覆盖率达38%,与GbMYB5有79%的相似性,编码一个R2R3-MYB转录因子。GhRAX3响应干旱诱变表达,在18%（v/v）PEG 6000诱导处理0.5 h后即显著上调表达5倍,在48 h后达上调表达33倍。亚细胞定位结果显示GhRAX3-GFP4融合蛋白仅在细胞核有明显的绿色荧光信号,表明GhRAX3定位在细胞核中。CLCrV病毒诱导GhRAX3沉默后,GhRAX3在沉默株的表达量仅为野生型的41%,表明GhRAX3表达已被抑制。取干旱处理前的棉花植株同部位的叶片,测定单位重量叶片在0-7 h内的失水量,发现GhRAX3沉默植株的叶片失水率显著高于野生型和空载体对照植株。在18%（v/v）PEG 6000水溶液处理24 h或在自然干旱15 d后,GhRAX3沉默的棉花植株萎蔫程度比野生型和空载体对照植株严重。自然干旱处理7 d后,检测叶片含水量、总抗氧化物酶活性、丙二醛含量和离子渗透率等抗旱相关生理指标,发现GhRAX3沉默植株的叶片相对含水量为82%,总抗氧化物酶活性为1.29 U·mg^-1,而野生型和空载体对照植株的叶片相对含水量则分别为89%和91%,总抗氧化物酶活性分别为3.44和3.19 U·mg^-1,GhRAX3沉默植株的叶片相对含水量和总抗氧化物酶活性都显著低于野生型和空载体对照植株;相反,GhRAX3沉默植株叶片的离子渗漏率为78.54%,丙二醛含量为74.20 nmol·mg^-1 FW,而野生型和空载体对照植株叶片的离子渗漏率分别为44.98%和47.45%,丙二醛含量分别为44.90和47.29 nmol·mg^-1 FW,GhRAX3沉默植株叶片的离子渗漏率和丙二醛含量均显著高于野生型和空载体对照。【结论】GhRAX3响应干旱胁迫诱导,抑制GhRAX3表达致使棉花在干旱胁迫条件下的叶片相对含水量和总抗氧化物酶活性显著降低,叶片离子渗漏率和丙二醛含量显著升高,使棉花耐干旱胁迫能力下降。