蚊耐氯菊酯C6/36细胞构建及耐药相关基因PR-XP1的表达分析

建立蚊耐氯菊酯C6/36细胞,并探讨PR-XP1基因与蚊C6/36细胞对氯菊酯的耐药性之间关系。采用逐步诱导法筛选蚊耐氯菊酯C6/36细胞,观察耐药细胞形态变化、生长状态,测定生长曲线和半数致死剂量;利用荧光实时定量PCR鉴定PR-XP1基因在敏感细胞与耐药细胞中的表达差异。获得耐400μg/m L氯菊酯的C6/36细胞;实时定量PCR检测发现抗药基因PR-XP1在蚊耐氯菊酯C6/36细胞中表达量明显上升。表明构建蚊耐氯菊酯C6/36细胞是研究蚊虫氯菊酯耐药性的有效方法,初步证明PR-XP1基因表达升高可能与蚊虫对氯菊酯的耐药性具有一定的相关性。     

牛DHX36解旋酶及其突变体底物结合与解旋活性研究

【目的】研究牛(Bos taurus)解旋酶DHX36(BtDHX36)及其突变体蛋白对含有G4结构底物结合和解旋活性的差异,为深入研究牛DHX36酶学特征和结构提供理论参考。【方法】制备底物16nt-ssDNA、Telomere G4和Telomere G4-16T,构建重组质粒pET15b-sumo-BtDHX36,通过Overlap PCR引入点突变,构建位于RSM区和OB域的突变重组质粒,分别将质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中诱导表达;经过Ni-NTA和Hi Trap SP HP柱纯化得到目的蛋白。以解离平衡常数为判定指标,利用荧光各向异性法(FA)对酶蛋白与底物结合时的KCl浓度(0,50和100 mmol/L)、反应温度(25,30和37℃)、MgCl_2浓度(0,2和5 mmol/L)、pH(6.5,7.5和8.5)进行优化,确定BtDHX36的体外最佳底物结合条件,比较野生型BtDHX36及其突变体对含有G4结构底物结合活性的差异。以解旋比例和速率常数为判定指标,利用快速停流-荧光共振能量转移(FRET)技术,比较野生型BtDHX36及其突变体对G4结构的解旋活性差异。【结果】成功构建了野生型BtDHX36重组质粒pET15b-sumo-BtDHX36及其RSM区突变体BtDHX36~(R63AI65A)、BtDHX36~(Y69A)、BtDHX36~(K76AN77AK78A)和OB域突变体BtDHX36~(Y862A)的重组质粒,诱导表达纯化后得到了纯度大于95%的酶蛋白。确定了野生型BtDHX36的体外最佳底物结合条件为:KCl 50 mmol/L、MgCl_2 2 mmol/L、20 mmol/L Tris-HCl pH=7.5、反应温度37℃。各突变位点均可降低酶蛋白与Telomere G4的结合活性。OB域的Y862A突变和RSM区K76AN77AK78A突变对酶蛋白解旋Telomere G4-16T活性均无明显影响;RSM区的R63AI65A和Y69A突变对酶蛋白解旋Telomere G4-16T均有较大影响。【结论】获得了高纯度的野生型BtDHX36及突变体酶蛋白,明晰了其体外最佳底物结合条件;RSM区的R63AI65A和Y69A突变均可明显降低酶蛋白解旋Telomere G4-16T的活性。     

一种嗜热菌Pif1解旋酶的表达纯化及活性分析

【目的】利用大肠杆菌表达纯化嗜热脱铁去硫弧菌(Deferribacter desulfuricans)解旋酶DePif1,并对其结合与解旋DNA的活性进行分析,为Pif1家族解旋酶结构和功能的阐明奠定基础。【方法】将促溶标签SUMO编码序列和人工合成的DePif1解旋酶编码序列依次连入pET15b载体,获得重组融合表达载体pET15b-SUMO-DePif1,然后将其导入E.coli BL21(DE3)菌株进行诱导表达;利用Ni-NTA亲和层析柱获得融合蛋白,SUMO蛋白酶酶切去除融合标签,再经Heparin和Ni-NTA柱分离获得无标签的纯化重组DePif1蛋白;采用荧光各向异性分析,研究pH和NaCl浓度对DePif1与DNA结合的影响及DePif1与不同底物(单链DNA、双链DNA和G4-DNA)的结合特性;使用基于荧光共振能量转移的stopped-flow技术,分析DePif1对不同底物(G4-DNA with 5′26nt tail和dsDNA with 5′26nt tail)的解旋活性。【结果】每升菌液可获得9 mg纯度大于95%的DePif1解旋酶。DePif1结合不同DNA底物的强度依次为G4-DNA单链DNA双链DNA,其对G4-DNA的解旋活力大于双链DNA。【结论】成功表达并纯化了嗜热脱铁去硫弧菌Pif1解旋酶,并证明其具有特异的G4-DNA结合和解旋能力。     

牛RECQL解旋酶的原核表达纯化及解旋条件优化

【目的】通过大肠杆菌表达纯化牛(Bos taurus)RECQL蛋白,利用停流光谱技术对解旋条件进行优化,为研究RECQL的酶促反应动力过程奠定基础。【方法】将人工合成的牛RECQL蛋白编码序列与pET21a载体相连接,获得重组表达载体pET21a-BtRecql后,将其导入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中进行诱导表达,经过Ni-NTA亲和层析和Superdex 200凝胶过滤层析,得到纯化的重组蛋白BtRECQL;再利用停流光谱技术对BtRECQL解旋过程进行检测分析,通过摸索不同的试验参数找到BtRECQL发挥解旋功能较适宜的条件。【结果】得到了纯度大于95%的BtRECQL蛋白,产量为0.29 mg/L。在BtRECQL浓度为60nmol/L,反应条件为1.0 mmol/L ATP,30mmol/L Tris-HCl,pH 7.5,60mmol/L NaCl,1mmol/L MgCl2,2mmol/L DTT,孵育温度为37℃时,该蛋白解旋活性较好。【结论】成功表达并纯化了BtRECQL蛋白,确定了其最优的解旋条件。     

蚊耐氯菊酯C6/36细胞构建及耐药相关基因PR-XP1的表达分析

建立蚊耐氯菊酯C6/36细胞,并探讨PR-XP1基因与蚊C6/36细胞对氯菊酯的耐药性之间关系.采用逐步诱导法筛选蚊耐氯菊酯C6/36细胞,观察耐药细胞形态变化、生长状态,测定生长曲线和半数致死剂量;利用荧光实时定量PCR鉴定PR-XP1基因在敏感细胞与耐药细胞中的表达差异.获得耐400μg/mL氯菊酯的C6/36细胞;实时定量PCR检测发现抗药基因PR-XP1在蚊耐氯菊酯C6/36细胞中表达量明显上升.表明构建蚊耐氯菊酯C6/36细胞是研究蚊虫氯菊酯耐药性的有效方法,初步证明PR-XP1基因表达升高可能与蚊虫对氯菊酯的耐药性具有一定的相关性.     

厌氧棒菌Pif1解旋酶的表达纯化及解旋条件优化

【目的】通过原核表达系统获得嗜热的厌氧棒菌(Anaerobaculum hydrogeniformans)DNA解旋酶Pif1(AnaPif1),研究其体外最佳解旋条件,为深入研究嗜热菌Pif1家族解旋酶工作机理提供参考。【方法】构建重组载体pET15b-sumo-AnaPif1,将重组载体转入表达菌株BL21(DE3)中诱导表达目的蛋白,经Ni-NTA柱和Heparin柱纯化最终获得全长AnaPif1蛋白;利用停流-荧光共振能量转移(FRET)技术,以pH值和Tris-HCl、NaCl、MgCl_2浓度及反应温度、能量供体为考察因素,以反应时间常数或速率常数为指标,摸索该蛋白在体外的最佳解旋条件、最佳能量供体以及底物的偏好性。【结果】成功构建了pET15b-sumo-AnaPif1重组表达载体,通过诱导表达,获得了纯度大于95%的全长AnaPif1蛋白,其大小为55ku,等电点为6.89。AnaPif1在体外的最佳解旋条件为:Tris-HCl(pH7.0)20mmol/L、NaCl 20mmol/L、MgCl_22mmol/L、反应温度37℃;其能够利用4种核苷三磷酸(ATP/GTP/CTP/UTP)作为能量供体,但对ATP有偏好性;该酶还能解旋多种底物(双链DNA、G4-DNA),且对底物选择无明显偏好性。【结论】获得了纯化的AnaPif1解旋酶,明晰了其最佳解旋条件、能量供体及底物的偏好性特征。     

热脱硫弧菌解旋酶基因TyPif1的原核表达、纯化及功能分析

【目的】通过原核表达系统获得热脱硫弧菌(Thermodesulfovibrio yellowstonii H.)Pif1解旋酶(TyPif1),研究TyPif1解旋酶的嗜热特性和解旋机理。【方法】将Typif1解旋酶编码区和SUMO促溶标签编码区融合连入pET15b获得重组表达载体pET15b-SUMO-TyPif1,将该重组载体导入大肠杆菌BL21(DE3)菌株诱导表达,经Ni-NTA柱亲和纯化获得融合蛋白,SUMO蛋白酶切除标签,再经Ni-NTA柱去除标签蛋白及SUMO蛋白酶,经Heparin柱进一步纯化最终获得TyPif1全长蛋白。通过荧光各向异性、圆二色谱(CD)和荧光共振能量转移(FRET)分析TyPif1解旋酶的DNA结合活性、解旋活性以及二级结构的热稳定性。【结果】获得了纯度大于95%的TyPif1蛋白,1L培养基可以获得约10mg纯度大于95%的蛋白;TyPif1解旋酶结合单链DNA和G4DNA的活性明显高于双链DNA;TyPif1具有较高的解旋G4DNA的活性,在25~60℃下其二级结构相对稳定,且解旋速率随温度升高而增大,25~50℃TyPif1的解旋速率由0.09s-1增大到0.23s-1。【结论】表达纯化了热脱硫弧菌TyPif1解旋酶,其不仅具有良好的热稳定性,同时具有特异的结合和解旋G4DNA的能力。     

鸡腿菇多糖硫酸酯化条件的优化及抗氧化活性研究

【目的】研究硫酸酯化修饰对鸡腿菇多糖(WPC)抗氧化活性的影响,为天然抗氧化剂的开发利用提供理论依据。【方法】采用氯磺酸-吡啶法,制备硫酸酯化多糖(SWPC);以取代度为指标,采用单因素试验对制备SW-PC的酯化条件进行优化;采用邻苯三酚自氧化法和邻二氮菲-金属铁离子-H2O2体系,研究SWPC的体外抗氧化活性。【结果】最佳酯化条件为:酯化试剂体积比(V(氯磺酸):V(吡啶))1:3,反应温度90℃,反应时间2h。SWPC对羟自由基和超氧阴离子自由基均具有清除能力;与WPC相比,SWPC清除羟自由基的能力显著提高,但清除超氧阴离子自由基的能力有所下降。【结论】SWPC对羟自由基和超氧阴离子自由基均具有一定的清除能力,但对不同基团的敏感性差异明显。     

超声波萃取技术在农业科学中的应用研究进展

超声波萃取技术已广泛用于食品、药物、工业原材料等样品中有机或无机组分的分离和提取，分析超声波萃取技术在农业科学研究领域中的应用，以促进超声波萃取在分离提取技术领域的发挥。     

超声波萃取技术在农业科学中的应用研究进展

超声波萃取技术已广泛用于食品、药物、工业原材料等样品中有机或无机组分的分离和提取,分析超声波萃取技术在农业科学研究领域中的应用,以促进超声波萃取在分离提取技术领域的发挥。