小麦条锈菌III型磷脂酰肌醇4-羟基激酶基因（PsPik1）的功能分析

【目的】克隆小麦条锈菌（Puccinia striiformis f. sp. tritici）III型磷脂酰肌醇4-羟基激酶基因（PsPik1）,分析其在小麦条锈菌生长发育与致病过程中的作用。【方法】利用RT-PCR技术克隆PsPik1的cDNA序列,采用生物信息学技术分析该基因编码蛋白分子特征并构建进化树;运用实时荧光定量PCR技术,选用小麦条锈菌的延伸因子（elongation factor,EF）作为内参,明确该基因在小麦条锈菌夏孢子阶段和侵染小麦后6、12、18、24、36、48 h以及3、5、7、9、11 d共12个发育时期的表达特征;利用病毒介导的基因沉默技术（BSMV-host-induced gene silencing,BSMV-HIGS）,分析沉默PsPik1后对小麦条锈菌生长发育及致病性的影响。通过传统酶切连接的方法构建重组载体BSMV:γ:PsPik1-as,利用体外转录技术获得BSMV α、β与γ3个组分,在小麦二叶一心期接种BSMV: γ:PsPik1-as、BSMV: γ:0-as与BSMV: γ:TaPDS-as。接种病毒后第10天,在小麦第4叶接种条锈菌CYR32,接菌后24、48、120 h分别取样,以检测PsPik1的沉默效率和进行组织学观察。样品经染色处理后,统计分析接菌后48 h沉默植株与对照植株中条锈菌菌丝分支数、吸器母细胞数与菌丝长度的差异,及120 h沉默植株与对照植株中条锈菌菌落面积的差异。在接菌后12 d观察条锈病发病情况并照相记录。【结果】PsPik1开放阅读框（open reading frame,ORF）全长4 485 bp,编码1 494个氨基酸,具有III型磷脂酰肌醇4-羟基激酶典型的脂激酶特有结构域（LKU）、钙神经传感蛋白（NCS1）结合位点、Hom2结构域和PI3K/PI4K超家族激酶结构域。聚类分析表明,PsPik1聚于PI4KIIIβ类群,PsPik1与柄锈菌属的Pik1亲缘关系较近,与子囊菌Pik1亲缘关系次之,而与动物及植物的PI4KIIIβ亲缘关系较远。实时荧光定量PCR结果表明,PsPik1在接种后6、12、18、24 h呈诱导上调表达趋势,分别为夏孢子时期表达量的2.66、7.04、3.42、2.96倍,其中在12 h其表达水平最高。接种后36 h至5 d,PsPik1的表达水平开始下降,一直低于夏孢子表达水平,分别为夏孢子表达量的60%、30%、16%、15%。接种后7-11 d,PsPik1的表达量开始升高,在接种后11 d恢复至与夏孢子相当的水平。PsPik1基因沉默后的组织学观察分析表明,与接种BSMV:γ:0-as（对照）相比,接种BSMV:γ:PsPik1-as植株中条锈菌组织分化与生长发育受到了不同程度的影响,表现在接菌后48 h菌丝长度和分支数目明显减小,接菌后120 h菌落面积明显减小。沉默效率检测结果显示,在接菌后24、48、120 h,接种BSMV:γ:PsPik1-as植株PsPik1的表达水平分别仅为对照植物的49%、49%、69%,表明PsPik1的表达明显地受到抑制。【结论】PsPik1可能参与了病菌侵染初期的侵染结构分化及寄生关系的建立,在条锈菌致病过程中发挥重要作用。     

北京地区芹菜细菌性软腐病菌鉴定及其致病力分析

 对从北京地区芹菜软腐组织中分离到的37株细菌性软腐病菌株,进行了微生物碳源利用(Biolog^TM)、生化特性、特异性PCR、ITS-RFLP带型以及基于16S rDNA完整序列遗传关系分析。结果如下:菌株革兰氏染色阴性、具周生鞭毛;可在5%和7% NaCl及28℃和37℃条件下生长;可分解柠檬酸盐及液化明胶;Biolog分析将这些菌株均鉴定为Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum (Pcc)。生化特性分析发现,其中36株菌株能利用D-山梨醇、D-阿拉伯糖醇、异麦芽酮糖和α-甲基葡萄糖苷,与对照菌株P. carotovorum subsp. odoriferum(Pco)S7一致;另外1株菌株Q34不能利用上述糖醇,与对照菌株P. carotovorum subsp. brasilience (Pcb)BC1和P. carotovorum subsp. carotovorum(Pcc)ECC71表现一致。利用pel(pectate lyase)基因特异性引物Y1/Y2在所有的37株菌株中均扩增出预期片段(434 bp),表明其基因组中均含有果胶酶基因。Pcb特异性PCR引物BR1f/L1r仅在Q34菌株与Pcb BC1中扩增出预期片段(322 bp),而Pcc特异性PCR引物EXPCCF/EXPCCR则在除Pcb BC1外所有菌株中均扩增出预期片段(550 bp)。Rsa I酶切16S-23S rDNA ITS片段结果显示,Q34酶切带型与Pcb BC1相同,其余36株带型与Pcc ECC71和Pco S7相同。基于16S rDNA基因完整序列,以Dickeya dadantii菌株582为外群,该37株菌株与已发表的Pectobacterium菌株系统发育树聚类分析结果表明,Q34与已发表的其他Pcb菌株形成了明显的Pcb类群,其余36株菌株则与已发表的其他Pco菌株形成了明显的Pco类群。综合多种鉴定结果,36株被鉴定为Pco,Q34被鉴定为Pcb。菌株致病力测试结果显示,36株Pco菌株中仅Q47表现为低等的致病力,其余24株和11株分别表现为中等和高等致病力;Pcb菌株Q34则表现出中等致病力。