抗鸡源EphA2蛋白小鼠多克隆抗体的制备及其特性研究

为深入探究鸡源EphA2生物学功能,试验首先对鸡源EphA2基因进行了原核分段克隆以及真核表达载体构建。重组原核表达载体分别命名为pGEX-6p-1-EphA2-A(1-534aa)和pGEX-6p-1-EphA2-B(585-972aa),真核表达载体命名为pcDNA3.1-EphA2。重组原核表达载体转化BL21后经IPTG诱导以及SDS-PAGE分析发现,融合蛋白GST-EphA2-A和GST-EphA2-B均获得有效表达。以纯化的GST-EphA2-A和GST-EphA2-B蛋白免疫小鼠制备了抗鸡EphA2多克隆抗体。间接免疫荧光试验以及Western blot试验表明,所制备的抗鸡EphA2多克隆抗体不仅能识别转染pcDNA3.1-EphA2的DF-1及LMH细胞中表达的外源性EphA2,而且还能有效识别内源性鸡源EphA2蛋白。本研究中鸡EphA2的成功表达及其多克隆抗体研制为后续研究鸡EphA2的功能提供了分子生物学工具。     

鸡TRAF3基因的克隆表达及多克隆抗体的制备

为探究鸡源肿瘤坏死因子受体相关因子3 (TRAF3)的生物学功能,对鸡源TRAF3基因进行克隆表达并制备其多克隆抗体。将鸡TRAF3基因分别克隆入原核表达载体pGEX-6P-1和真核表达载体pcDNA3.1中构建出重组原核表达载体pGEX-6P-1-TRAF3和重组真核表达载体pcDNA3.1-TRAF3。构建的原核表达载体转化入大肠埃希菌BL21后经IPTG诱导,SDS-PAGE分析表明获得GST-TRAF3的融合表达蛋白,且融合蛋白主要表达于包涵体中。将纯化的GST-TRAF3蛋白免疫小鼠制备抗GST-TRAF3多克隆抗体。间接免疫荧光及Western blot试验表明,所制备的抗TRAF3多克隆抗体不仅能与转染pcDNA3.1-TRAF3的DF-1及LMH细胞中表达的外源性TRAF3反应,而且能有效识别LMH细胞内源性的鸡源TRAF3蛋白。该研究中鸡TRAF3基因的克隆、表达及其多克隆抗体制备为后续研究鸡TRAF3的功能奠定了基础。     

血凝素蛋白145位潜在糖基化位点对H9N2禽流感病毒生物学特性的影响

从某肉鸡场分离的A/Chicken/Jiangxi/106/2012(H9N2)(JX106)毒株,其HA蛋白在145位氨基酸由S突变为N,使得在该处增加了一个潜在的糖基化位点NGT。本研究以JX106为研究对象,通过反向遗传操作获得重组病毒rgJX106-HA145N和rgJX106-HA145S。利用不同方法探究了HA蛋白145位糖基化位点对病毒的毒力、复制、受体亲和力和致病性等方面的影响。研究发现,rg JX106-HA145N和rg JX106-HA145S在A549细胞上的复制、对鸡胚的感染力无明显差异,而HA蛋白145位无糖基化位点的rg JX106-HA145S与α2,6-唾液酸受体的亲和力更强,在小鼠肺脏中复制更快、致病力更强且能产生更高的交叉HI效价,这一结果提示流感病毒血凝素的糖基化对病毒诱导的体液免疫具有重要影响。     

鸡源EphrinA2基因的克隆表达及其单克隆抗体研制

研究旨在研制抗鸡EphrinA2蛋白的特异性单克隆抗体。试验用PCR和同源重组技术构建了鸡EphrinA2真核及原核表达载体,以纯化的EphrinA2原核表达产物免疫小鼠,将小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,用间接ELISA方法筛选出阳性细胞克隆;用SDS-PAGE、间接免疫荧光试验和Western blot验证表达产物及单抗的特性。结果显示：原核表达的重组蛋白His-EphrinA2-RBD主要位于细菌包涵体中;获得2株能稳定分泌抗EphrinA2蛋白特异性抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为4H6和1G9;单克隆抗体4H6不仅能特异性识别真核表达载体pcDNA3.1-EphrinA2在DF-1细胞中表达的EphrinA2蛋白,而且能有效识别LMH和DF-1细胞中内源性的EphrinA2蛋白。结果表明,单克隆抗体4H6与鸡EphrinA2蛋白反应性和特异性均良好,能够应用于鸡EphrinA2相关基础研究。