一种简便分离高质量家蚕基因组DNA的方法

本研究对传统的家蚕基因组提取方法进行了改进.改进方法无需研钵和液氮,将RNase与蛋白酶K同时加入剪碎的家蚕样品中消化处理,并利用旋转振荡培养箱旋转混匀和培育每步的样品.该方法减少了基因组DNA的损失,提高了工作效率,节约了成本.利用改进后的方法对不同家蚕品种的基因组DNA进行了提取和PCR扩增验证,结果表明提取的基因组DNA的质量、获得率、重复性都更好,能够满足家蚕分子生物学研究的需要.     

TILLING技术应用于家蚕化学诱导突变检测的体系优化

TILLING（Targeting Induced Local Lesions In Genomes）即定向诱导基因组局部突变技术,是近年发展起来的一种高通量检测点突变的反向遗传学方法。本研究从PCR模板量及酶切体系中CELI的酶量两个方面对家蚕TILLING技术的检测体系进行了优化。结果表明：本实验在应用TILLING技术筛选家蚕突变体过程中,用于PCR扩增的家蚕基因组DNA模板最佳用量为20ng;CEL I酶切的20μL反应体系中,加入的最适酶量为0．5μL（本实验室从芹菜中自提的CELI酶10倍稀释液）。本研究初步对TILLING技术应用于家蚕化学诱导突变检测体系进行了优化,为TILLING技术在家蚕功能基因组研究中的应用奠定了基础。     

CELⅠ酶的粗纯化及活性分析

TILLING（Targeting-induced local lesions in genomes）技术作为反向遗传学的一个重要研究工具，目前在众多的模式生物分子生物中得到广泛应用，其中CELⅠ酶是TILLING技术的核心。本实验通过硫酸铵沉淀、亲合层析、阴阳离子交换柱层析等常规的蛋白质纯化过程，从芹菜中粗纯化了具有较高活性的稳定的CELⅠ酶。并以杂合双链DNA为底物，对不同纯化程度的CELⅠ酶以及在不同温度、处理时间、有无Taq DNA多聚合酶的条件下进行了CELⅠ酶的错配切割活性分析。结果发现，所获得的CELⅠ酶得到了一定的纯化；CELⅠ酶的反应最适温度范围为40℃～50℃；长时间酶切特异性好；在含有Taq酶的酶切体系中，CELⅠ酶错配切割效果更佳，这与已报道的实验结果基本一致。与其他单位提供的CELⅠ酶活性相比，本实验分离纯化的CELⅠ酶活性值略高。通过对CELⅠ酶的提取及活性分析，为TILLING技术大规模和低成本的应用于家蚕功能基因组研究提供了保障。     

利用Ecotilling技术筛选家蚕E群突变体的突变基因

对突变体的发现与鉴定是揭示基因功能的一种有效手段。为了研究家蚕E群突变体的基因多样性,利用Ecotilling技术平台,对家蚕18个E群突变体中的14个Hox基因片段(总长408 kb)进行突变筛选,获得了48个错义突变和213个沉默突变,其中60%是转换型突变,即嘌呤突变为嘌呤,嘧啶突变为嘧啶。研究结果表明,11个Hox基因片段在不同E群突变体中发生了突变,其中在E群突变体06-250中的Bmshx7基因有不同的错义突变位点,特别在homeobox结构域也有突变发生,这些突变可能会影响到Bmshx7基因的功能,即影响对目标基因的转录调控,最终产生突变体06-250相应的突变表型。研究获得的Hox基因的其它突变信息目前与E群突变体的表型尚无直接关联,但其研究结果可为继续筛选鉴定E群突变基因以及探讨基因的功能提供有价值的信息。