基于微流控芯片电泳的番茄黄化曲叶病毒快速检测

【目的】探索微流控芯片电泳方法在PCR产物检测方面的效果,并建立针对番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV）的微流控芯片电泳检测方法,弥补琼脂糖凝胶电泳方法在试剂消耗、所用时间、安全性方面的缺陷。【方法】通过对TYLCV的基因组进行分析后,在该基因组中相对稳定的位置设计引物,同时兼顾引用已被研究者研究过的引物,对这些选择的引物进行特异性、稳定性、灵敏度等方面的验证,筛选出用于后续试验的引物。选择DNA标准物φX174/BsuR I(Hae Ⅲ) marker,分别进行琼脂糖凝胶电泳和微流控芯片电泳,对二者在耗材、耗时和灵敏度方面进行比较,确定微流控芯片电泳在核酸检测方面的应用价值。利用筛选出的其中1对引物对番茄叶片的实际样品进行PCR扩增,随后通过微流控芯片电泳对其进行检测,以此探讨微流控芯片电泳在病毒检测方面的检测效果。【结果】共筛选出14对TYLCV备用引物,其中2对引自文献,12对为本文设计,每对引物均可满足微流控芯片检测要求。选择其中1对引物TYLCV-T作为随后的研究对象。利用琼脂糖凝胶电泳和微流控芯片电泳对DNA标准物检测,结果表明微流控芯片电泳在耗时方面不足琼脂糖凝胶电泳的1/10,约为13 min,试剂消耗为琼脂糖凝胶电泳的1/8,检测灵敏度方面至少比琼脂糖凝胶电泳高103倍,根据DNA标准物原液浓度计算可知,微流控芯片电泳至少可准确检测到浓度为5×10-6 μg?μL-1的核酸样品。利用微流控芯片电泳对TYLCV-T扩增的TYLCV PCR产物进行检测,将检测峰值图与DNA标准物的峰值图时间比较,就可判断出产物峰的大小范围。【结论】筛选出的关于TYLCV的备用引物可作为进一步研究微流控芯片技术在该病毒检测方面的基础;通过将琼脂糖凝胶电泳和微流控芯片电泳进行比较,确立了后者在核酸检测方面的应用价值;通过微流控芯片电泳对TYLCV PCR产物的检测,建立了基于微流控芯片电泳的TYLCV快速检测方法,为TYLCV的快速检测提供新的技术支持。     

基于液滴微流控的壳寡糖植物免疫诱导剂荧光检测

为了建立基于液滴微流控芯片平台的植物免疫诱导剂的荧光信号检测技术,该文设计制作了具有液滴生成结构的芯片,制备包裹烟草(BY-2)细胞的液滴,并对包裹了细胞的液滴数目进行统计分析。将包裹细胞的液滴孵育一氧化氮探针后使用质量浓度为50μg/m L壳寡糖处理,在荧光显微镜下观测其产生的荧光,利用荧光酶标仪对比采用96孔板和液滴承载的细胞的荧光变化趋势。结果显示,水相流速为100μL/h,油相流速为300μL/h时,微流控芯片产生的液滴尺寸适合包裹细胞,其中液滴包裹单细胞的比例达22.9%。经壳寡糖处理后的细胞在生成的液滴中产生了明显的荧光,且用96孔板和液滴承载的细胞的荧光变化趋势一致。研究结果为开发基于液滴微流控技术的植物免疫诱导剂的高通量筛选平台提供参考。     

基于培养池阵列微流控芯片的单线虫并行分离条件考察

秀丽隐杆线虫是一种重要的模式生物,已广泛应用于生物医药、农业和植物方面的研究,但线虫体态微小,常规方法难以实现对单条线虫的精准操控和长期追踪。本研究基于微流体控制技术,设计了培养池阵列微流控芯片,提出一种单线虫并行分离方法。通过考察液体培养时的线虫密度、线虫体宽及其分布等影响因素,分析在芯片上进行单线虫并行分离的条件。结果显示,采用无菌液体培养时,线虫密度对线虫体宽及其分布具有明显影响,高密度（约700条/mL）培养组和低密度（约300条/mL）培养组的线虫体宽分别为 （35.5±5.2） μm和（40.0±1.8） μm,且低密度下培养的线虫可获得较好的芯片分离效果,所得含线虫与含单线虫培养池的比例分别为83.3%和66.7%。该并行分离方法相对简便、可靠,结合其微流控芯片结构和流体控制方式,有望用于自动化单线虫长期培养和观测研究。     

基于液滴技术的烟草细胞免疫应激信号的检测

基于液滴微流控芯片技术,用壳寡糖(chitosan oligosaccharide,COS)处理悬浮培养的烟草细胞(BY-2cell),对烟草细胞产生的免疫应激信号分子(H_2O_2和Ca~(2+))进行荧光检测。用50μg/mL的壳寡糖水溶液分别刺激装载过氧化氢和钙离子荧光探针的烟草细胞,在荧光显微镜下观察到烟草细胞产生的荧光;以液滴微流控芯片为实验平台,研究发现水相流速为100μL/h,油相流速为300μL/h时,液滴尺寸为300μm,适合烟草细胞的包裹,在该条件下将COS与荧光探针孵育后的细胞包裹在液滴中,在荧光显微镜下观察到液滴中的荧光;后用荧光酶标仪检测96孔板和液滴承载的细胞的荧光强度,结果显示1h内两者的变化趋势一致。试验为液滴微流控芯片在植物免疫诱导剂和生物农药方面的研究提供了参考。