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在转基因检测领域,标准质粒以容易获得、纯度高、成本低和稳定性好的优点逐渐被广泛应用,适合同时检测多个靶标基因的需求。本研究针对我国抗虫棉(Gossypium hirsutum L.)的主要外源基因类型,构建含有豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(CpTI)、苏云金杆菌晶体杀虫蛋白基因(cry1A)和棉花内标准基因硬脂酰-酰基载体蛋白脱饱和酶基因(Sad1)的多靶标质粒pMD-CCS作为标准质粒,建立了CpTI和cry1A基因的实时荧光定量PCR方法。测定了我国9个抗虫棉品种中的CpTI和cry1A基因剂量,显示科棉3号等3个抗虫棉品种中CpTI基因的平均剂量为0.020~0.018拷贝/基因组,cry1A基因的平均剂量为1.377~2.136拷贝/基因组;鄂杂棉1号F1等6个抗虫棉品种中cry1A基因的平均剂量为0.887~2.564拷贝/基因组,定量结果的标准差(SD)范围在0.001~0.149之间。结果说明,pMD-CCS适合作为标准物质用于抗虫棉中CpTI和cry1A基因的定量测定。 相似文献
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来源于花椰菜花叶病毒(Cauliflower mosaic virus)的CaMV35S启动子是目前商业化转基因作物中最常用的启动子,对其甲基化水平的测定是研究转基因沉默的重要内容之一。本研究通过甲基化敏感内切酶HpyCH4Ⅳ酶切和实时荧光定量PCR扩增技术,建立了CaMV35S启动子甲基化水平的快速测定方法。利用建立的方法分析了我国安徽省2017年市场的棉花(Gossypium hirsutum)种子,发现部分种子中CaMV35S启动子甲基化处于较高水平。本研究为实现转基因材料中CaMV35S启动子甲基化的快速高通量筛查提供了检测方法。基于相同的原理也可以建立其他转基因元件和DNA序列甲基化水平的快速检测方法。 相似文献
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本实验利用TRIZOL试剂提取水稻苗期叶片总RNA,对三种常用的RNA纯化方法和改进的纯化方法进行了比较。通过凝胶电泳、紫外分光光度法和RT-PCR法检测提取的RNA样品的品质,结果表明,应用改进的RNA纯化方法可有效去除水稻RNA中的DNA污染,电泳条带清晰无降解;OD260/OD280为1.91~1.98,具有较高的纯度;改良方法纯化的RNA逆转录为cDNA,作为PCR扩增的模板,以不同的循环数进行扩增,在反应适宜循环数内检测不到DNA片段污染,说明用改进方法提取的RNA,其质量和纯度可以满足下一步分子生物学研究的需要。 相似文献
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转cry1Ac基因抗虫棉鄂杂棉1号的旁侧序列和品系特异性检测 总被引:2,自引:0,他引:2
为更好地了解我国转基因棉花的转化品系,建立快速准确的品系鉴别方法,本研究采用长链PCR、Genome Walking的方法解析转基因抗虫棉(Gossypium hirsutum L.)新转化品系鄂杂棉1号的整合结构和外源DNA整合的基因组旁侧序列.以旁侧序列为靶标,设计引物,对引物的筛选优化、特异性和灵敏度测试结果显示,建立的鄂杂棉1号品系定性PCR检测方法具有特异性,检测灵敏度为40个拷贝,相当于100 ng模板的0.1%.对市场的21个样品棉花样品检测,有3个样品检测出具有与"鄂杂棉1号"相同转化品系来源,表明本研究建立的品系特异性检测方法可应用于我国转基因棉花育种材料的鉴别和筛选. 相似文献
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一种检测转Bt基因抗虫棉新棉33B和GK-12的PCR方法 总被引:2,自引:1,他引:1
测定了转基因抗虫棉新棉33B和GK-12的Bt基因表达盒的序列,发现它们在Bt基因和Bt基因与终止子连接区的序列存在差异,而在启动子与Bt基因连接区的序列完全一致。基于这种结构上的差异,设计3条特异性引物MG-P1、MG-P2和MG-P3,建立了检测这两个转基因抗虫棉的双重PCR方法。采用建立的方法,检测了40个转基因棉花样品,其中,只含有新棉33B的Bt基因结构的样品数为32个;只含有GK-12的Bt基因结构的样品数为6个;同时含有两者结构的样品数为2个。 相似文献
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苍耳Xanthium sibiricum和藜Chenopodium ablum是我国北方及黄淮海玉米产区主要杂草,其发生和生长会严重影响玉米产量.为明确我国北方及黄淮海玉米主产区的藜和苍耳对草铵膦的敏感性水平,本试验采用整株生物测定法检测苍耳和藜种群对草铵膦的敏感性,以期为转基因抗草铵膦玉米田杂草防控提供数据支持.结果... 相似文献
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转cry1Aa基因抗虫棉整合结构解析及转化体特异性检测方法的建立 总被引:1,自引:1,他引:0
【目的】cry1Aa基因是2011年本实验室在我国棉花商品种子中发现的1种未经批准的转基因成分,本研究旨在通过整合结构解析,建立特异性检测方法,对市售棉种进行初测,明确该外源基因在我国棉种中的存在情况。【方法】通过Genome walking、长链PCR分离获得了转cry1Aa基因棉花转化体(定名为NN6转化体,简称NN6)的外源基因整合结构,同时基于插入位点基因组及外源DNA连接区,建立了NN6转化体特异性的定性聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)方法和实时荧光定量PCR方法。【结果】NN6整合结构主要包括cry1Aa、aad和Npt II基因,插入棉花基因组7号染色体37 169 450位,产生91 bp基因组缺失;所构建的定性PCR检测方法能特异、快速地对棉花单株和种子单粒中NN6转化体的纯/杂合状态进行鉴定,实时荧光定量PCR检测限为44拷贝,能满足国内外对转基因标识的需要;对含有cry1Aa基因的3个市售棉种进行检测,其纯合度分别为1.51%,5.21%和21.09%。【结论】本研究解析了NN6的整合结构,并建立特异性检测方法,为我国转基因棉花新品种选育及转基因安全管理提供技术手段。 相似文献
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马唐Digitaria sanguinalis、牛筋草Eleusine indica、狗尾草Setaria viridis和虎尾草Chloris virgata是我国北方和黄淮海玉米田4种主要禾本科杂草,是影响玉米产量和品质的主要因素之一。为了明确禾本科杂草对草甘膦的敏感水平,本研究采用整株生物测定法测定上述4种杂草种群对草甘膦的敏感基线,为将来我国种植转基因耐草甘膦玉米后,玉米田杂草防除提供数据支撑。结果表明,马唐55个种群GR50值范围在13.36~550.28 g a.i./ha,均值为120.02 g a.i./ha。狗尾草69个种群GR50值范围在7.22~201.96g a.i./ha,均值为50.45 g a.i./ha。牛筋草50个种群GR50范围在25.19~808.54 g a.i./ha,均值为218.78 g a.i./ha。测定的所有马唐、狗尾草和牛筋草种群GR50值均低于900 g a.i./ha(田间推荐中剂量),表明这三种杂草对草甘膦敏感。虎尾草34个种群GR 相似文献