利用单根肌纤维法分离和培养猪骨骼肌卫星细胞及其成肌诱导分化

建立单根肌纤维法体外培养猪骨骼肌卫星细胞的体系,了解其增殖和成肌特性。通过Ⅰ型胶原酶消化,从猪骨骼肌中分离完整的单根肌纤维并培养,用细胞免疫荧光鉴定肌纤维上的卫星细胞,随后对从单根肌纤维上游离出来的卫星细胞进行细胞免疫荧光染色,传代培养,成肌诱导分化和Western blot分析骨骼肌卫星细胞成肌特异性蛋白的表达。结果显示:分离并培养的单根肌纤维上附着有卵圆形的细胞,并随时间的推移,细胞缓慢向外迁移并增殖,卫星细胞特异性标志基因对盒转录因子(Paired protein box,Pax7)和成肌分化抗原(Myogenic Differentiation Antigen,MyoD)免疫荧光染色呈阳性,且阳性率达到90%以上。成肌诱导分化后,细胞开始汇合,并呈方向性生长,最终形成多核肌管,且成肌特异性标志基因Myogenin和myosin heavy chain(MyHC)表达呈阳性。MyoD蛋白高表达于增殖期,而Myogenin和MyHC在进入分化期才表达。该实验成功建立了猪骨骼肌单根肌纤维的体外培养方法并获得了高纯度的卫星细胞,为骨骼肌卫星细胞进行活体移植治疗相关疾病研究提供了实验材料。     

常见中草药对两种肠道有益菌体外生长的影响

为了解中草药对机体肠道有益菌两歧双歧杆菌、嗜酸乳杆菌体外生长的影响 ,探讨中草药的使用前景。选取清热解毒类的板蓝根、柴胡、连翘 ,泻下类的厚朴、大黄、芒硝 ,补益类的枸杞子、地黄、五味子共 9种常见中草药制成浸提液 ,添加于有益菌体的外生长培养基中 ,采用亨盖特厌氧滚管技术活菌计数。结果显示清热解毒类中药在 3种试验浓度下对两歧双歧杆菌的生长没有显著影响 ,对嗜酸乳杆菌均有抑制作用 (P <0 .0 5 ) ,但不同浓度下抑制作用不同 ;泻下类中药均强烈抑制 2类有益菌的生长 (P <0 .0 1或P <0 .0 5 ) ,且随着浓度的增加抑制作用增强 ;而补益类中药对 2种试验菌均有明显的促进生长作用 (其中对双歧杆菌P <0 .0 5 ) ,且随着浓度增加 ,促进效果增强。因此认为 :在调节肠道微生态平衡方面发挥一定的作用。     

排酸处理对湘南黄牛氨基酸以及脂肪酸的影响

[目的]为改善湘南黄牛肉用品质,并在生产中推广应用。[方法]试验选取6头同一品种、月龄接近的湘南黄牛经同一饲喂条件育肥后进行屠宰,测定排酸前后牛肉中氨基酸、脂肪酸含量等指标。[结果]结果表明,排酸牛肉组氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、肌氨酸、色氨酸、∑鲜味氨基酸、∑苦味氨基酸含量显著升高(P0.05);丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苏氨酸、瓜氨酸、∑甜味氨基酸含量显著降低(P0.05)。排酸牛肉十二酸、十四酸、十五酸、顺-11-二十碳烯酸、饱和脂肪酸(SFA)含量显著升高(P0.05);顺-9,12,15-十八碳三烯酸、顺-8,11,14-二十碳三烯酸、顺-5,8,11,14-二十碳四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸、多不饱和脂肪酸(PUFA)、PUFA/SFA、n-6 PUFA、n-3 PUFA含量显著降低(P0.05)。[结论]最终得出,通过排酸处理湘南黄牛能够满足人体从肉类摄取氨基酸的需求,同时有效改变脂肪酸含量,提高肉用品质。     

中药对鸡肠道微生物菌群的影响

试验研究了在肉鸡饲养中以中药作为添加剂对鸡肠道主要微生态菌群的影响。结果发现：中药组和化学药物组相比，有益菌乳杆菌大量增加，达到了极显著差异(P＜0．01)。双歧杆菌达到显著差异(p＜0．05)；而有害菌肠杆菌大量降低，达到了极显著差异；肠球菌虽然有显著差异，但其增加的幅度没有乳杆菌大，说明中药组可以显著调节肉鸡肠道的微生态平衡。     

LiCl激活经典Wnt信号通路诱导猪骨骼肌卫星细胞向慢肌分化

Wnt/β-catenin信号通路参与调控细胞的增殖及分化,决定细胞的命运。LiCl通过抑制GSK-3β(glycogen synthetase kinase-3β)稳定细胞内β-catenin的表达。为研究Wnt/β-catenin信号通路在哺乳动物骨骼肌卫星细胞成肌分化过程中的作用。以原代培养猪骨骼肌卫星细胞为实验材料,将其培养在含有1%CEE和20%胎牛血清的GMEM培养液中,再用15 mmol/L LiCl诱导分化,并采用免疫荧光染色和Western blotting等方法检测经典Wnt信号通路中相关因子及成肌分化过程中细胞的蛋白表达。结果表明:LiCl处理猪骨骼肌卫星细胞后促进分化,p-GSK-3β、β-catenin、myosin及慢肌蛋白增加,p-β-catenin、GSK-3β及快肌蛋白减少,并且核内源性β-catenin增多。结果提示,激活Wnt/β-catenin信号通路促进骨骼肌卫星细胞成肌分化,并且诱导其向慢肌分化。     

不同Ca2+浓度下猪肉肌球蛋白的热聚集体机制研究

为探究不同Ca~(2+)浓度下肌球蛋白的热聚集行为,以猪背最长肌为原料,提取其肌球蛋白,加入不同浓度的氯化钙(0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.075、0.1 mol/L),通过热变性动力学分析,研究加热过程中聚集体形态结构的变化和凝胶特性,探究猪肉肌球蛋白热聚集形成机制。结果表明,氯化钙浓度由0.01 mol/L升至0.1 mol/L,蛋白变性温度由40.2、52.4℃降至36.5、50.8℃,显著(p 0.05)降低了肌球蛋白的热稳定性;随着温度的升高、氯化钙浓度的增加,肌球蛋白浊度、粒度、变性率逐步增大;显著(p 0.05)提高了肌球蛋白初始状态的Ca~(2+)-ATP酶活性,降低了肌球蛋白互相结合形成聚集体的温度;电镜观察发现,Ca~(2+)浓度越高,聚集速率越快,0.1 mol/L处理下,蛋白聚集体体积显著增大,形成无序聚集体; 80℃、0.1 mol/L处理组凝胶强度显著(p 0.05)高于其他处理组,氯化钙浓度由0.01 mol/L升高至0.1 mol/L,凝胶强度由4.58 N升至5.28 N。因此,随着温度升高、氯化钙浓度增加,易形成猪肉肌球蛋白聚集体,且凝胶强度增加。     

不同碳源饲粮对安格斯牛×湘西黄牛肉常规养分、品质及核苷酸含量的影响

为研究不同碳源饲粮对安格斯牛×湘西黄牛（♂×♀,安本杂牛）肉常规养分、品质及核苷酸含量的影响,试验选取20月龄左右、体重相近、健康状况良好的去势安本杂牛21头,随机分为3组,每组7头。对照组饲喂常规饲粮,玉米组饲喂以玉米淀粉为主要碳源的饲粮,大麦组饲喂以大麦淀粉（在玉米组基础上用大麦替代玉米）为主要碳源的饲粮,玉米组和大麦组按等氮原则进行配制。玉米组和大麦组粗饲料为水稻秸秆,精粗比为9:1,试验期100d。试验结束后,试验牛空腹12 h后屠宰,取12～13肋背最长肌分析常规养分和品质;排酸24 h后取12～13肋背最长肌进行核苷酸含量分析。结果表明：（1）玉米和大麦组淀粉摄入量极显著高于对照组（P <0.01）,分别增加了251.90%和241.77%,大麦组粗蛋白质摄入量显著高于对照组（P <0.05）,增加了34.26%。（2）大麦组牛肉水分含量显著低于对照组（P <0.05）,大麦组和玉米组粗脂肪含量极显著高于对照组（P <0.01）,分别增加了106.71%和83.84%。（3）各组肉色、剪切力和pH24 h差异不显著（P> 0.05）,玉米组b*...     

KLF15基因表达特征及其腺病毒超表达载体的构建

【目的】分析锌指蛋白转录因子15(KLF15)在小鼠各组织及C2C12细胞分化过程中的表达情况,构建KLF15的腺病毒超表达载体。【方法】采集小鼠肝、脾、肾、脂肪、骨骼肌及培养的C2C12成肌细胞,提取不同分化时期(0,2,4d)的C2C12细胞及不同组织的RNA,检测KLF15的表达情况;过夜连接HindⅢ和XbaⅠ双酶切后的pAdTrack-CMV与KLF15真核表达质粒(pcDNA3.1-KLF15),获得pAdTrack-KLF15质粒。将该质粒经PmeⅠ线性化后转入BJ5183感受态细胞进行重组,构建pAdEasy-KLF15腺病毒超表达载体。将pAdEasy-KLF15质粒PacⅠ酶切线性化回收后,转染293A细胞进行包装、扩繁和纯化。将获得的KLF15重组腺病毒侵染C2C12细胞,实时荧光定量PCR检测其对KLF15表达的影响。【结果】KLF15在C2C12成肌细胞分化过程中表达显著升高,并在分化后期达最高值;KLF15在肝脏、肾脏和脂肪中的表达水平极显著高于骨骼肌和脾脏。成功获得了pAdEasy-KLF15腺病毒超表达载体,其侵染C2C12细胞后能显著上调KLF15mRNA的表达水平。【结论】KLF15基因在C2C12成肌细胞中高表达,并成功构建了KLF15重组腺病毒载体。     

Wnt/β-catenin信号通路相关基因及MyHCs在猪骨骼肌发育中的表达规律

为研究Wnt/β-catenin信号通路对猪骨骼肌纤维类型发育的影响,并探讨其潜在的作用机制.本研究以1日龄、1周龄、2周龄、1月龄、2月龄和6月龄大白猪背最长肌组织为研究材料,利用Real-time PCR、Westernblot、冰冻切片免疫组化等方法,研究Wnt/β-catenin信号通路相关基因及MyHCs在猪骨骼肌发育过程中的表达规律.Real-time PCR结果显示:MyHC-Ⅰ、GSK-3β、#catenin和Fz3 mRNA随着个体日龄增加表达量下降,MyHC-Ⅱb mRNA表达逐渐升高,MyHC-Ⅱa mRNA表达量在1日龄～2周龄阶段升高后又降低,MyHC-Ⅱx mRNA 表达量变化不显著;免疫组化结果显示:快肌蛋白呈棕色,慢肌蛋白呈灰白色,在出生1日龄～1周龄时,快、慢肌呈弥散交叉分布,到2周龄时慢肌簇被快肌包被在肌束中间,随着年龄增加,慢肌簇逐渐减少.Western blot检测结果显示:慢肌蛋白从出生到2周龄显著下降,在2周龄～2月龄阶段下降不明显,生长到6月龄时又显著降低;快肌蛋白随日龄增加而增加,在2周龄～6月龄期间增加极显著;β-catenin、GSK-3β蛋白表达量与其mRNA表达一致,而p-β-catenin在2周龄时显著高于1日龄,且随后持续上调;Tyr216p-GSK-3β蛋白表达量早期生长下调极显著;ser9 p-GSK-3β蛋白表达量则是在后期生长显著降低.上述基因表达变化规律揭示,Wnt/β-catenin信号通路相关基因β-catenin、Fz3、GSK-3β与MyHC-Ⅰ表达呈正相关,与MyHC-Ⅱ表达呈负相关,其在骨骼肌生长过程中对肌纤维类型组成具有重要影响.