黄瓜CsRAX2的克隆与表达分析及原核表达蛋白诱导

作为最大的转录因子家族,MYB转录因子广泛参与植物的生长发育以及对胁迫的响应与耐受。CsRAX2是黄瓜MYB转录因子家族成员之一,本研究通过同源克隆法克隆了CsRAX2全长,分析了该转录因子基因的生物信息和表达特征,在原核表达系统中诱导并纯化该蛋白。结果表明,CsRAX2全长939 bp,编码321个氨基酸,定位在3号染色体。CsRAX2蛋白定位在细胞核,与其他物种MYB的进化关系很近,是一个典型的R2R3-MYB转录因子。CsRAX2表达具有组织特异性,且低温处理显著诱导采后黄瓜CsRAX2表达,表明其可能在采后黄瓜低温反应调控中发挥作用。启动子元件分析显示,该基因启动子中含有多个环境和激素响应元件,表明非生物胁迫可能通过激素信号调控CsRAX2表达。原核表达研究表明,培养温度影响原核表达蛋白的诱导效果,降低细菌培养温度能提高上清液中融合表达蛋白产量。本研究结果为进一步研究黄瓜CsRAX2基因的生物学功能及黄瓜耐冷性机理提供了帮助。     

CsCAT3克隆与其在冷驯化诱导采后黄瓜耐冷性中的作用初探

为研究CsCAT3基因在冷驯化诱导采后黄瓜耐冷性中的作用,采用同源克隆法克隆了CsCAT3基因,并对其基本特性进行分析,研究了冷驯化处理对采后黄瓜CsCAT3表达、CAT活性和过氧化氢(H₂O₂)含量的影响。结果表明,CsCAT3基因的开放阅读框长度为1 476 bp,编码492个氨基酸残基。CsCAT3的理论分子量为57.01 kDa,等电点为6.84,为亲水性蛋白质,无跨膜结构域,定位在过氧化物酶体。CsCAT3与4种模式植物CAT3的同源性介于69.29%~71.82%之间,物种间CsCAT3的同源性和保守性很高。冷驯化处理可明显上调CsCAT3在转录和蛋白水平上的表达,提高CAT活性,降低H₂O₂含量,表明CsCAT3基因在冷驯化诱导的耐冷性中具有重要作用。本研究为进一步解析CsCAT3在采后黄瓜诱导耐冷性中的功能奠定了基础。     

黄瓜CsCOLD1基因的特征及低温下表达变化

G蛋白偶联受体是重要的信号传导因子,在低温信号应答中发挥着重要作用。COLD1(chilling tolerance divergence 1)编码1个G蛋白信号调节因子,可能作为低温信号感受器发挥作用。以采后黄瓜作为试验材料,克隆CsCOLD1的全长序列,分析其序列特性及其在低温处理期间的表达变化。结果显示,CsCOLD1基因全长1 443 bp,编码480个氨基酸残基;CsCOLD1蛋白定位在细胞膜、叶绿体上,含有9次跨膜结构,是一个跨膜蛋白;黄瓜CsCOLD1与拟南芥等双子叶植物COLD1蛋白的氨基酸序列同源性较高,两者COLD1的进化关系较近,葫芦科植物COLD1的GPHR＿N与ABA＿GPCR结构域高度保守;在6℃低温处理下CsCOLD1表达量在叶片中基本没有变化;在5、10℃低温处理下,CsCOLD1的表达量在采后黄瓜中显著下调。虽然未在CsCOLD1启动子中鉴定到低温响应元件,但检测到乙烯响应元件、MYB和MYC转录因子结合位点,表明该基因是一个逆境胁迫相关基因。CsCOLD1蛋白的氨基酸序列中含有多个磷酸化位点,表明其可能在磷酸化后发挥功能。     

黄瓜果实CsMYB62克隆及其对CsGR-RBP3表达的调控

本研究前期证实,低温诱导的CsGR-RBP3表达与黄瓜果实耐冷性密切相关,但调控其表达的具体机理尚不清楚。为鉴定调控CsGR-RBP3表达的MYB转录因子,本研究采用转录组测序,分析了黄瓜果实在5℃低温处理后的转录组变化,并通过共表达趋势分析,鉴定了与CsGR-RBP3表达趋势一致的MYB基因。结果发现,CsMYB62与CsGR-RBP3表达的相关性很高,且低温处理能诱导黄瓜果实CsMYB62和CsGR-RBP3表达,推测CsMYB62转录因子可能调控CsGR-RBP3表达。为进一步分析CsMYB62基因的功能,从黄瓜果皮中克隆了CsMYB62基因全长序列。结果显示,CsMYB62基因全长834 bp,编码277个氨基酸残基。CsMYB62蛋白含有SANT保守域和MYB DNA结合域,定位在细胞核,在进化过程中高度保守。CsMYB62蛋白具有转录激活活性,能直接绑定到CsGR-RBP3启动子,增强CsGR-RBP3启动子活性,表明CsMYB62通过直接调控CsGR-RBP3表达而增强黄瓜果实耐冷性。本研究结果丰富了MYB调控网络,为进一步解析CsMYB62功能奠定了理论基础。