猪轮状病毒VP4、VP6蛋白原核表达及多克隆抗体的制备

猪轮状病毒(porcine rotavirus, PoRV)属于呼肠孤病毒科,轮状病毒属,是引起幼年仔猪发生腹泻的主要病原之一,常与其他病原发生混合感染。PoRV结构蛋白VP4、VP6分别组成病毒的纤突及内衣壳,在病毒侵入、复制以及维持病毒粒子形态中起到重要作用。为研究PoRV VP4和VP6蛋白相关特性,分别扩增VP4开放阅读框中抗原性较好的两部分：58～1 080 bp基因片段(1 023 bp)、1 657～2 328 bp基因片段(672 bp),以及VP6完整开放阅读框(1 191 bp),成功构建重组表达质粒pET32a-VP4-672、pET32a-VP4-1023和pET32a-VP6,经测序正确后转化BL21感受态细胞中,经IPTG诱导,重组蛋白均以包涵体形式表达,融合蛋白大小分别约为44,58,64 kDa,与预期大小相符。将纯化后的蛋白免疫新西兰大白兔,制备兔源多克隆抗体,间接ELISA方法测定多抗效价均在1∶10⁶以上,免疫印迹(Western blot)和间接免疫荧光(IFA)检测结果显示多抗均可与病毒蛋白产生良好的抗原抗体反应。本研究结...     

生物钟基因在绒山羊皮肤中表达模式的比较

文章旨在研究绒山羊皮肤生物钟基因clock、tim、per1和cry1的表达模式,进而分析其在绒山羊皮肤组织中的作用及相互关系。生物钟基因形成一个转录-翻译反馈环,通过钟基因在绒山羊皮肤生长周期进行高表达,激活per1和cry1基因的转录-转化过程,从而在mRNA和蛋白水平的调控下进行有节律的表达。结果表明,这些生物钟基因在绒山羊皮肤中的表达量依次为:clocktimper1cry1;皮肤次级毛囊兴盛期,高振幅clock、per1、tim、cry1的节律表达分别出现在一天中的04∶00、08∶00、08∶00、16∶00;皮肤次级毛囊休止期,这些基因的高振幅节律表达分别出现在一天中的08∶00、04∶00、04∶00、16∶00。另外,cry1、per1基因的表达在生物钟基因正反馈循环中被激活,tim基因的表达在生物钟基因的负反馈循环中被激活。因此,clock、tim、per1和cry1调控下运行的钟基因反馈环是绒毛生长呈周期性现象的基础。     

绒山羊不同肌肉组织及肌内脂肪细胞的基因表达分析

试验旨在研究脂肪沉积关键基因在内蒙古白绒山羊的表达规律,以期深入分析绒山羊肌内脂肪沉积特征.利用实时荧光定量PCR技术检测PPARγ、FTO、Lipin、LPL、HSL、A-FABP和Perilipin7个基因在绒山羊10个不同肌肉组织及肌内前体脂肪细胞分化的3个时期(早期(D3)、中期(D7)、末期(D11))、诱导分化关键时间点(24、48、72和96 h)的变化,分别从组织和细胞角度对其进行分析,并研究其与肌内脂肪含量的关系.结果表明,FTO基因的表达水平高于其他基因;Lipin基因的表达量最低;LPL和HSL是脂肪合成和分解的关键酶类,其表达趋势大致相同,仅仅在腰大肌和斜方肌这两个部位的表达模式相反.A-FABP和Perilipin基因表达模式也较为特殊,整体表达量较低,前者仅仅在胸下矩肌中有较高表达,后者在股二头肌中有较高表达.从细胞水平分析发现Lipin、PPARγ、A-FABP和Perilipin的表达模式相似,随着前体脂肪细胞培养日龄的增加和甘油三酯的积聚,其表达量逐渐升高;Lipin基因在各个时间点的表达丰度极低;HSL基因的表达量随分化程度的升高而逐渐降低;Perilipin基因仅仅在诱导分化的后期有较高表达.相关性统计分析发现,PPARγ基因mRNA与肌内脂肪多呈负相关;而其他成脂基因HSL、LPL、FTO、Lipin、Perilipin、A-FABP mRNA与肌内脂肪含量多呈正相关.因此,脂肪沉积关键基因的表达具有特异性,总体上看基因表达量为FTO> PPARγ> LPL >HSL> A-FABP >Perilipin >Lipin,该结果为进一步研究脂肪沉积机制及优化山羊肉品质奠定基础.     

绒山羊皮肤蛋白双向电泳条件的优化与常见问题分析

为建立和优化绒山羊(Capra cashmere)皮肤组织蛋白质双向电泳技术(2-DE),本研究从样品提取及纯化方法、上样量、IPG胶条的选择、等电聚焦程序等多个方面对双向电泳分离条件进行比较研究。结果显示,液氮研磨+超声波破碎法提取皮肤组织蛋白质,2-D clean up kit试剂盒进行纯化,采用17 cm pH4～7的IPG胶条450μg上样量,等电聚焦程序重复数次除盐步骤,获得的2-DE图谱效果较好;同时对实验中遇到的常见问题进行了讨论分析。结果表明,通过优化的双向电泳条件,建立了较高分辨率和较好重复性的绒山羊皮肤组织双向电泳图谱,可以进行后续实验。本研究获得良好的绒山羊皮肤组织蛋白双向电泳图谱,验证了绒山羊蛋白质组学研究的可行性,为后续进行绒山羊皮肤毛囊发育周期蛋白质组学研究、揭示毛囊发生发育规律提供了重要的技术资料。     

内蒙古白绒山羊毛囊发育周期蛋白质表达谱分析

山羊绒毛的产量和绒毛纤维的质量与角蛋白有关。本研究旨在探讨内蒙古白绒山羊(Capra cashmere)毛囊差异表达蛋白质的变化规律,采用双向凝胶电泳(two dimensional gel electrophoresis,2-DE)技术分离一年中12个月份毛囊总蛋白质,建立了毛囊发育周期蛋白质图谱。使用质谱鉴定差异表达蛋白点,并分析部分蛋白点的表达趋势。结果表明,12个月样本的2-DE图谱显示,平均每块胶上可检测到255个蛋白点,分布在pI 4~7,分子量30~85 kD;软件分析得到20个差异表达蛋白点,质谱成功鉴定出12种蛋白质;这些蛋白质主要为角蛋白(keratin,K),参与细胞生物过程并发挥生物学功能。将12个月做以下划分:11、12、1和2月4个月归为毛囊退行期,3和4月归为毛囊休止期,此时蛋白质表达量明显降低;5、6、7、8、9和10月归为毛囊兴盛期,蛋白质表达量为一年中最高。初步得出K1、K5、K71和K25在毛囊发育的兴盛期表达量高,可能促进毛囊的生长发育。K83和K10在毛囊休止期表达量高,可能与毛囊的休止有关。研究建立了良好的皮肤毛囊蛋白质表达谱,分析并鉴定了差异蛋白质及其表达趋势,对于从蛋白质组学研究内蒙古白绒山羊毛囊生长和发育,寻找标记蛋白应用于绒山羊育种提供了新的研究线索。     

内蒙古绒山羊皮肤蛋白质双向电泳条件优化及图谱建立

试验旨在建立内蒙古绒山羊皮肤蛋白质双向电泳图谱。采用液氮研磨法提取蛋白质,通过双向电泳技术对蛋白质进行分离,分别对不同的蛋白质沉淀方法、上样量和SDS-PAGE凝胶浓度进行比较。结果显示,使用2-D Clean-up试剂盒处理、上样量为20 μg、采用10%的SDS-PAGE凝胶浓度时可获得重复性好和分辨率高的双向电泳图谱,便于后续的内蒙古绒山羊皮肤差异蛋白质组学分析。     

肉碱的生物合成、转运及其在畜牧业中的应用

肉碱是1905年在肌肉中发现的一种必需代谢产物,它的主要生理功能是将细胞液中的长链脂肪酸转运到线粒体中参与脂肪酸β-氧化为机体提供能量.近年来,肉碱作为一种改善畜禽生产和繁殖性能的必需营养物质,在畜牧生产中的应用越来越广泛.作者综述了肉碱的生物合成、转运及其在畜牧业中的应用,以期为肉碱相关研究提供理论依据和思路.     

猪流行性腹泻病毒反向遗传学及其研究进展

猪流行性腹泻病毒（PEDV）是高度接触性肠道传染病猪流行性腹泻（PED）的病原,是有囊膜的单股正链RNA病毒,基因组全长约28 kb。2010年以来,PEDV G2型高致病性毒株不断发生变异,给全国乃至全球的养猪业造成巨大的经济损失。反向遗传学系统,即构建RNA病毒的全长感染性克隆。近年来,PEDV主要基于靶向RNA重组、BAC系统和体外连接3种方法来建立全长感染性cDNA克隆。文章简述了反向遗传学的原理和方法。靶向RNA重组利用冠状病毒RNA的高同源重组的特点来实现病毒的拯救;BAC系统利用pBeloBAC11载体克服PEDV基因组中含有的毒性序列所导致的cDNA在高拷贝质粒中不稳定的困难;体外连接技术主要利用PEDV基因组本身存在的限制性内切酶的酶切位点或通过改造的酶切位点在体外将病毒分片段地连接成全长的cDNA克隆。另外,文章还总结了近年来基于反向遗传学技术的PEDV相关的研究进展。PEDV反向遗传学是研究PEDV病毒基因组结构功能及设计减毒活疫苗的有效工具,利用反向遗传学技术探究S基因等毒力相关基因,探究其突变或缺失对病毒致病机制的影响,揭示PEDV毒力衰减的分子机制,有望设计出具有良好免疫原性且避免毒株返毒和重组减毒活疫苗。总之,PEDV反向遗传学是研究PEDV基因组结构及功能、病毒宿主相互作用及致病机制的一种重要方法,同时也是设计PEDV减毒活疫苗一种合理有效的途径。     

猪流行性腹泻病毒特异性SIgA 间接ELISA检测方法的建立及初步应用

以乳汁中SIgA特有的成分SC蛋白为研究对象，运用基因克隆、原核表达等方法，制备兔抗猪SC多克隆抗体，使用猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV) S截短蛋白进行包被后，初步建立了一种可以检测母猪初乳中PEDV特异性SIgA抗体的ELISA方法。结果显示，PEDV特异性SIgA检测方法具有特异性强、敏感性高、重复性好等特点。结果表明，该方法适用于检测临床中SIgA。该方法的成功建立为生产中评估仔猪从乳汁中获得SIgA的效率及制定更为完善的母猪免疫程序提供了有效的技术支持。