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鲤鱼白细胞介素-8全长cDNA的克隆、鉴定及其差异表达分析 总被引:1,自引:0,他引:1
用DD-RTPCR的方法获得差异显示片段A26,经地高辛标记作为探针对有丝分裂原刺激的鲤鱼外周血白细胞cDNA文库核酸杂交筛选,从0.8×104个重组噬菌体中,经过2轮筛选获得阳性克隆。序列分析表明该克隆含有1个大小为294bp编码98个氨基酸的完整开放阅读框,氨基酸序列含有Chemokine-CXC功能结构域,前体中含有22个氨基酸组成的引导肽,氨基酸序列比对显示成熟白细胞介素-8(IL-8)多肽中第12、13和14构成CXC基序,但之前无ELR基序。系统发生分析其与荷兰鲤鱼亲缘关系最近,氨基酸序列的同源性达89%。分离培养鲤鱼外周血白细胞,在不同条件下经LPS、PHA和ConA刺激后,提取总RNA,根据鲤鱼IL-8全长cDNA序列和β-ac-tin序列设计引物,利用半定量反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法对鲤鱼外周血白细胞IL-8进行差异表达分析,结果显示,经有丝分裂原刺激后前期(4h)白细胞中IL-8的表达量明显增大,但随着时间推移(12、24h)并不一直比同期正常白细胞表达量大,表达量趋势成峰形图。 相似文献
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利用旋毛虫新生幼虫期特异性 c DNA探针 ,从新生幼虫 c DNA文库中筛选出 2个相似的旋毛虫新生幼虫期特异性 c DNA克隆 ,分别命名为 N5和 N10 ,N5长度为 12 5 0 bp,N10长度为 12 33bp。 NCBI Blast检索表明 ,2个c DNA全长序列均为旋毛虫新基因序列。DNASIS分析表明 ,N5与 N10的开放阅读框架分别为 10 14、10 17bp,编码338、339个氨基酸 ,推导的成熟蛋白氨基酸序列均为 32 1个氨基酸残基 ,相对分子质量推导值分别为 35 30 0和 354 0 0。 2个氨基酸序列中 N端均包含有一信号肽序列 ,可能为分泌性蛋白。NCBI Blast及 Inter Proscan检索表明 ,以上2个氨基酸序列均含有 型核酸酶的功能结构域 ,均编码 型核酸酶 (DNase ) ,且与已报道的旋毛虫包囊形成相关蛋白 P4 3(经鉴定也为 DNase )同源性最高。目前已有的试验结果证实 ,P4 3并未直接参与包囊的形成 ,而是一种与P4 3蛋白同源性非常高的蛋白参与了旋毛虫包囊的形成。由于 N5与 N10为旋毛虫新生幼虫期特异性表达基因 ,也就是在旋毛虫包囊形成的时期表达 ,而且与 P4 3具有较高的同源性 ,并均编码 DNase 蛋白 ,因此 N5、N10具有参与旋毛虫包囊形成的潜在可能 相似文献
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采集多浪羊的血液,分离白细胞,提取总RNA,用白细胞介素8(IL-8)的引物进行两步法的RT-PCR扩增、克隆与酶切鉴定,测序后进行序列比对,与NM_001009401.1同源性高达99%,初步判定为多浪羊的IL-8编码全长cDNA。通过序列比对,发现多浪羊IL-8的基因起始密码子上游第七个碱基发生突变,在NM_001009401.1中是T,而在测序的多浪羊的IL-8中是C。对该测序序列进行数据库搜索和序列比对,发现该碱基变异很独特,并对该变异可能对mRNA蛋白翻译的影响进行了初步的分析。 相似文献
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利用DD-RTPCR(正常鲤鱼外周血白细胞和经有丝分裂源刺激后白细胞的总RNA)获得的差异显示片段B10克隆(编码IL8的一段序列),对该基因进行DIG标记,对有丝分裂原刺激的鲤鱼外周血白细胞cDNA文库进行核酸杂交筛选,从0.8×104个重组噬菌体中,经过2轮筛选最终获得阳性克隆,挑选了3个分别命名为IL8-1,IL8-2,IL8-3。测序后经NCBI Blast分析表明,阳性克隆具有完整阅读框架,均为编码鲤鱼IL8的全长cDNA,编码的多肽由98个氨基酸残基组成,其相对分子质量理论推导值为 10 848.9 Da,等电点为8.68。且与2003年12月Dev Comp Immunol.杂志报道的荷兰鲤鱼氨基酸的同源性达84%。 相似文献
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旋毛虫肌幼虫cDNA文库的免疫筛选及初步分析 总被引:1,自引:1,他引:0
用旋毛虫感染猪血清对旋毛虫肌幼虫cDNA文库进行了免疫筛选,从1 6×105个重组噬菌体中筛选出21个阳性克隆。阳性克隆的测序结果表明:有9个克隆为未曾报道过的新基因;有9个克隆不含有开放阅读框架(ORF),与旋毛虫线粒体DNA同源,编码核糖体大亚基RNA;3个克隆为旋毛虫已知基因,其中克隆ML12,34与Serineproteaseinhibitor[Trichinellaspiralis](AAF63473)同源性为99%,克隆ML42与HypotheticalOFR17 20[Trichinellaspiralis](AAB48489)同源性为99%,与21kDExcretory secretoryprotein[Trichinellapseudospiralis](AAF79206)同源性为90%,这为进一步研究基因重组抗原奠定了基础。 相似文献
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[目的]从Genbank数据库中选择与新疆沙冬青(Ammopiptanthus nanus)亲缘关系最近的同属蒙古沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)抗冻蛋白(AFP)基因AY590122、AY843521、AY843522的mRNA序列,设计扩增新疆沙冬青AFP基因保守区引物.[方法]以新疆沙冬青为研究材料,提取其总RNA,利用RT-PCR技术克隆出新疆沙冬青AFP基因的保守区域.[结果]序列分析表明,新疆沙冬青与蒙古沙冬青的保守区域同源性达98.15;.[结论]得到新疆沙冬青的抗冻蛋白的保守区域. 相似文献
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[目的]克隆卡拉库尔羊TNF-α基因,在大肠杆菌中表达、纯化,并对TNF-α蛋白的抗原性进行分析.[方法]采用PCR技术扩增TNF-α基因核酸片段,并克隆入pET-28b表达质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)株中表达.用电洗脱法纯化目的蛋白,并用免疫印迹法分析纯化蛋白的抗原特异性.[结果]重组质粒在BI21 (DE3)菌株中经IPTG诱导表达一个相对分子质量约为49 KD的融合重组蛋白,原核表达质粒pET-28b-TNF-α表达的目的融合蛋白是以可溶的形式存在.用纯化的pET-28b-TNF-α免疫家兔,在免疫后的第45 d,Westem-blotting和琼脂糖扩散试验分析表明,表达的pET-28b-TNF-α能被家兔的阳性血清所识别.[结论]表达蛋白pET-28b-TNF-α具有较好的反应原性和免疫原性. 相似文献
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