卵母细胞生发泡破裂(GVBD)发生前后脱卵丘细胞对猪卵母细胞体外成熟的影响

成熟卵母细胞的细胞质对供体细胞的重编程有作用,卵母细胞的成熟状态成为核移植过程的关键因素。为了研究卵母细胞体外成熟过程中卵母细胞生发泡破裂(germinal vesicle breakdown,GVBD)发生前后脱卵丘细胞对卵母细胞的影响,本研究采用猪(Sus scrofa)卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complexes,COCs)于体外培养,每隔5 h取卵母细胞采样,置于地衣红染液中染色,根据卵母细胞染色体构型的变化确定卵母细胞的分期,然后在21、27和42 h的卵母细胞进行脱卵丘细胞处理,观察极体数。体外培养不同时间压片观察结果表明,直径2~6 mm卵泡卵母细胞在体外培养时,2~17 h大部分卵母细胞处于GV期(88.30%~52.38%);22 h有63.25%的卵母细胞处于生发泡破裂至前中期(germinal vesical breakdown~premetaphaseⅠ,GVBD~pre-MⅠ);27 h处于中期Ⅰ(metaphaseⅠ,MⅠ)的卵母细胞最多(42.25%);32 h处于后期Ⅰ(anaphaseⅠ,AⅠ)的卵母细胞比例最多(29.90%);37 h处于末期Ⅰ(telophaseⅠ,TⅠ)的卵母细胞比例最多(40%);42 h绝大部分卵母细胞达到了中期Ⅱ(metaphaseⅡ,MⅡ)(72.81%)。分别采取21、27和44 h的卵母细胞进行脱卵丘细胞处理,发现21 h脱卵丘细胞后卵母细胞成熟率为25.56%,低于27 h处理卵的成熟率(34.33%),42 h脱卵丘细胞的卵母细胞的成熟率最高达到84.33%。结果说明,体外卵母细胞成熟过程中,卵丘细胞对卵母细胞的成熟具有重要意义,为进一步探讨和分析猪卵母细胞体外成熟培养的方法,改良体外培养体系,提高猪卵母细胞体外培养成熟率,进而提高胚胎体外培养质量提高奠定基础。     

超表达细胞周期蛋白A2基因(CycA2)抑制猪卵母细胞PB1体外排出

在卵母细胞成熟过程中,细胞周期蛋白A2(CyclinA2,CycA2)可与不同周期蛋白依赖激酶(cyclindependent kinase,CDK)相互作用,通过其周期性表达和降解,参与调控细胞周期.为探讨CycA2基因对猪(Sus scrofa)卵母细胞体外成熟的影响,本研究从猪卵巢中克隆CycA2基因,构建野生型pVenus-CycA2和非降解型pVenus-DN157CycA2真核表达载体,转染至hela细胞,确认重组质粒的表达及定位情况.将pVenus-CycA2、pVenus-DN157CycA2体外转录为cRNA,对猪卵母细胞进行显微注射后,体外成熟培养一段时间后统计第一极体排出率,并观察其表达和定位.结果显示,显微注射了pVenus-CycA2、pVenusDN 157CycA2cRNA的卵母细胞,其第一极体(first polar body,PBl)的排出率与对照组相比极其显著降低(P＜0.001,);用Roscovitine处理的pVenus-DN 157CycA2表达的卵可恢复排出PB1的能力,其PB1排出率与对照组相比差异不显著.本研究首次揭示了CycA2基因对猪卵母细胞体外成熟过程的影响,为探索CycA2参与染色体分离调控的分子机制提供理论依据,同时也为进一步研究第二次减数分裂过程中CycA2基因的作用提供了一个平台.     

超表达线粒体融合蛋白2基因(Mfn2)抑制小鼠卵母细胞体外成熟

线粒体融合蛋白2基因(mitofusin2,Mfn2)参与细胞凋亡和细胞周期调控,在卵母细胞和胎盘发育中起着重要作用.本研究旨在探讨Mfn2基因对小鼠(Mus musculus)卵母细胞体外成熟过程的影响.从小鼠卵巢中克隆Mfn2基因并构建pMfn2-Venus真核表达载体.经脂质体2000介导重组质粒pMfn2-Venus转染293T细胞(病毒包装细胞),确认重组质粒在293T细胞内的表达及定位.将pMfn2-Venus体外转录为cRNA,并注射入小鼠卵细胞中,进行体外成熟培养,并统计卵母细胞生发泡破裂(germinalvesiclebreakdown,GVBD)发生率以及第一极体(first polarbody,PB1)排出率,荧光显微镜下观察其表达及定位.结果显示,注射了Mfn2-Venus cRNA的卵母细胞,其GVBD发生率以及PB1排出率与对照组相比显著降低(P＜0.0001,P＜0.05).本研究首次揭示了Mfn2基因对小鼠卵母细胞体外成熟过程的影响,为卵母细胞体外成熟的研究提供了一个新方向,同时也为研究减数分裂过程中Mfn2基因提供了一个平台.