动物乳腺特异表达载体的构建及其表达特性研究

为了研制动物乳腺生物反应器,用中国奶山羊β-乳球蛋白基因的5′、3′-侧翼区和β-酪蛋白基因的第1内含子构建动物乳腺特异表达载体p205C3.细胞表达试验结果显示,p205C3载体能够指导lacZ基因在SV40 T基因转化的山羊乳腺上皮细胞中表达,不能指导该基因在COS-1细胞和山羊成纤维细胞中表达.将人激肽释放酶(hKLK1) cDNA克隆入p205C3载体,用获得的重组载体p205C3KLK1注射哺乳期小鼠,然后取其心、肝、脾、肺、肾、脑、肌肉、胰腺和乳汁,酶活性测定结果显示,乳汁中的酶活性高达255.65 U·mL-1,其他组织中的酶活性与正常小鼠无差异.结果表明p205C3载体不仅能有效地指导外源基因在山羊乳腺细胞和小鼠乳腺中表达,而且表达具有较好的组织特异性,可以用于动物乳腺生物反应器的研制.     

人胰腺激肽释放酶cDNA的克隆、序列分析和原核表达

摘要: 为了研制人激肽释放酶（KLK1）特异单克隆抗体和进行重组酶的鉴定及纯化，根据已发表的人KLK1序列设计引物，用PCR扩增法从人胰腺单链cDNA库中特异地扩增出KLK1 cDNA。将其克隆入pGEM-T载体中,对5个重组质粒进行了序列测定，其中1个cDNA克隆的核苷酸序列与已发表的人肾/胰/唾液腺KLK1 cDNAs序列完全相同或有3个核苷酸差异。将去除信号肽序列的KLK1 cDNA以正确阅读框插入表达载体pGEX-4T-3,构建成重组质粒pGEX-KLK1。此重组质粒转化的E.coli 经IPTG诱导后表达分子量为48 kDGST-KLK1融合蛋白，表达产物主要以不溶性包涵体形式存在，可溶性部分能被Glutathione Sepharose 4B特异吸附，两者都能被GST特异单克隆抗体识别。用SDS-PAGE分离纯化的融合蛋白免疫小鼠，获得的抗血清的ELISA效价为1∶1600。结果表明，克隆的人KLK1 cDNA及其表达产物是正确的，可以用于人KLK1单克隆抗体的制备。     

奶山羊β-乳球蛋白基因及其调控区的克隆和序列分析

从奶山羊组织提取基因组 DNA,根据已发表的山羊 β-乳球蛋白基因 (BLG)序列设计引物 ,用高保真长模板PCR法克隆得 6个奶山羊 BLG基因片段。这 6个基因片段的大小和部分限制性酶切图谱与已发表的山羊 BLG基因相同。部分序列测定结果显示 :6个奶山羊 BLG基因片段与山羊 BLG基因相应片段的同源性为 99%。进一步序列测定结果表明 :奶山羊 BLG基因 5′调控区与山羊、绵羊和牛的同源性分别为 99%、95%和 90 % ,3′调控区与这些动物的同源性分别为 99%、97%和 92 %。在乳腺特异表达调控元件集中的 -4 0 6bp区域内 ,奶山羊 BLG基因与山羊 BLG基因有 2个碱基的差异。所克隆的奶山羊 BLG基因调控区与山羊 BLG伪基因显著不同 ,其同源性仅为 83 % (上游调控区 )和88% (下游调控区 )。这些结果表明 :不同种动物的 BLG基因是高度保守的 ,高保真 PCR克隆的奶山羊 BLG基因调控区可用于乳腺特异表达载体的构建     

人溶菌酶cDNA的克隆及其在小鼠体内的表达

根据已发表的人溶菌酶 (human lysozyme,h L YZ) m RNA序列设计引物 ,以人乳腺第 1链 c DNA为模板 ,用 PCR扩增出 1.5 kb h L YZ双链 c DNA,其推导的氨基酸序列与国外发表的从胎盘、巨噬细胞和结肠中克隆的 h L YZ氨基酸序列同源性为 10 0 % ,与从人组织细胞中克隆的 h L YZ仅有 1个氨基酸差异 ,但与从中国人胎盘中克隆的 h L YZ具有6个氨基酸差异。将此 c DNA克隆入乳腺特异表达载体 ,用所获得的基因构件注射哺乳期小鼠 ,经 RT- PCR和微球菌溶解试验证明 ,上述基因构件能有效地驱动目的基因在小鼠乳腺中表达 ,表达量为 6 9.3mg/ L,表达具有较好的组织特异性。这些试验结果表明 ,本研究构建的表达 h L YZ c DNA的基因构件可以用于乳腺生物反应器的研制。     

奶山羊β—乳球蛋白基因及其调控区的克隆和序列分析

从奶山羊组织提取基因组DNA，根据已发表的山羊β－乳球蛋白基因（BLC）序列设计引物，用高保真长模板PCR法克隆得6个奶山羊BLG基因片段，这6个基因片段的大小和部分限制性酶切图谱与已发表的山羊BLG基因相同，部分序列测定结果显示：6个奶山羊BLG基因片优山关BLC基因相应片段的同源性为99％，进一步序列测定结果表明：奶山羊BLG基因5调控区与山羊，绵羊和牛的同源性分别为99％，95％和90％，3调控区与这些动物的同源性分别为99％，97％和92％，在乳腺特异表达调控元件集中的－406bp区域内，奶山羊BLG基因与山羊BLG基因有2个碱基的差异，所克隆的奶山羊BLG基因调控区与山羊BLG伪基因显著不同，其同源性仅为83％（上游调控区）和88％（下游调控区），这些结果表明：不同种动物 的BLG基因是高度保守的，高保真PCR克隆的奶山羊BLG基因调控区可用于乳腺特异表达载体的构建。β     

可控细胞膜孔形成蛋白基因的克隆与表达

根据Wood 46株金黄色葡萄球菌a溶血素(a-HL)基因序列设计了引物，用高保真PCR从1800株金黄色葡萄球菌基因组DNA中扩增出了0．9kb的a-HL基因，序列测定结果显示，两菌株a-HL基因的核苷酸序列有6个碱基差异，但仅引起1个氨基酸替换。用PCR分段克隆和定点突变技术将大肠埃希氏茵外膜蛋白A信号肽序列与a-HL编码区融合，并将其第130～134位氨基酸替换为5个连续的组氨酸，获得的融合基因命名为H5基因。将其克隆入pET-30a质粒，用获得的重组质粒pET-H5转化感受态大肠埃希氏菌，获得分泌性表达H5的重组茵。经IPTG诱导后，重组菌表达出分子质量为35ku的H5蛋白。经镍柱亲和层析纯化的H5对兔红细胞的半数溶血值为180ng／mL，能使鼠成纤维细胞PA317获得对台盼蓝和海藻糖的通透性，且能被Zn^2 抑制。提示，表达的H5蛋白为可控细胞膜孔形成蛋白，能用作真核细胞内玻璃态保存的渗透剂。